浙江大学胶体金免疫标记培训班资料(1)

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班技术资料胡东维洪健徐颖浙江大学2001年10月浙江大学胶体金免疫标记培训班资料2浙江大学胶体金免疫标记培训班资料1一、胶体金的制备根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范围内。在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10nm的胶体金时建议使用该方法。利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16nm直径的胶体金。除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5ml试管分装为1ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16nm胶体金(1)取一250ml三角瓶，加入79ml双蒸水和1ml1％氯化金，预热至60～浙江大学胶体金免疫标记培训班资料270℃。(2)取一50ml烧杯，加入4ml1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25mMK2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5ml时，对pH的影响不大，K2CO3可以省略。(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。柠檬酸钠（ml）单宁酸（l）胶体金（nm）450003420004450064120847010410162、白磷还原法制备5nm胶体金(1)取250ml三角瓶一个，加79ml双蒸水，1ml1%氯化金，并用0.25MK2CO3将溶液调至中性（pH7.0）。(2)取0.2ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5ml试管中，再加0.8ml乙醚，混匀。取0.7ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用CuSO4进行中和)。(3)室温下轻轻摇匀15min，然后加热沸腾并保持5min，自然冷却。3、柠檬酸三钠法制备12-30nm胶体金(Frens,1973)(1)取250ml三角瓶一个，加100ml双蒸水及1ml1%氯化金，加热沸腾；(2)取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。柠檬酸钠(ml)胶体金(nm)512416324浙江大学胶体金免疫标记培训班资料3注意：(1)由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。(2)胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。但决不可保存在0℃以下，否则金粒子发生凝聚。二、蛋白-金复合体的制备一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值，在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30kD），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值。对于理浙江大学胶体金免疫标记培训班资料4化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同pH值得胶体金结合后，只有某一特定pH值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。但有些探针的实际情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。在确定最佳pH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定变化。因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。1、抗血清的前处理一般抗血清中IgG的含量为10-25%，而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致IgG活性的大幅降低。如果你的实验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更好。大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白。其基本步骤如下：(1)取抗血清0.2ml；(2)加生理盐水（0.85％NaCl）0.3ml，混匀；(3)逐滴加入饱和(NH4)2SO40.5ml，充分振荡混匀，4℃静置1h；(4)10000rpm/min离心20min，弃上清；(5)加0.5ml生理盐水重悬浮，混匀；(6)逐滴加0.25ml饱和(NH4)2SO4，充分振荡混匀，4℃静置1h；(7)10000rpm/min离心20min，弃上清；(8)重复5～8步骤一次；(9)加生理盐水0.5ml重悬浮，混匀；浙江大学胶体金免疫标记培训班资料5(10)生理盐水中透析12～24h；(11)在0.2MpH9.0硼酸缓冲液透析12～24h；(12)分装，即将使用时4℃保存，备用-20℃保存。为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为3MKCNS透析，促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探针。2、亲和纯化抗体的处理亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是IgG分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。其基本步骤如下：(1)将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为0.5-1mg/ml浓度(2)在3MKCNS（硫氰酸钾）溶液中透析12h(3)在2mMolpH9.0的硼酸缓冲液中透析12h（更换透析液数次）(4)分装备用其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的pH值应与交联时pH值一致。在实际运用中，一般省略去3MKCNS透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗IgG，ProteinA，ProteinG，Streptavidin）等时，严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。3、IgGFab片段的制备一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。IgG分子量为150kD左右，由4个亚基组成，即两条重链（H）和两条轻链（L）。用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即Fab和Fc。其中浙江大学胶体金免疫标记培训班资料6Fab是具有抗原识别活性的部分，回收后制备探针。Fc能够与ProteinA和ProteinG特异性结合。但这种分离只能在有条件的实验室进行。其基本过程如下：(1)用PBS（pH7.0，含10mMEDTA，20mM盐酸半胱氨酸）溶解纯化的IgG(2)加固化木瓜蛋白酶(3)37℃处理5h(4)离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀）(5)过ProteinG柱(6)纯化的Fab片段按前文方法做进一步处理注：Fab与胶体金结合的pH值为6.54、蛋白与胶体金结合最佳pH测定(例纤维素酶，pI未知)(1)取若干个1.5ml试管，分别加入1ml10nm胶体金；(2)用25mMK2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；(3)取一96孔培养板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100l加入孔中，重复三次；(4)每孔分别加入3l浓度为1mg/ml的纤维素酶，混合，室温下放置10-15min；(5)每孔分别加入20l浓度为10％NaCl溶液，混合，室温下放置10min；(6)观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(X)；(7)重复(1)-(5)步，pH梯度为X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。(8)观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持红色的最低pH。注意：1．如胶体金粒子直径较小（3～6nm），加NaCl需放置较长时间（几个甚至十几个小时）后才能观察到颜色变化。必要时可放大反应体积（1ml胶体金），浙江大学胶体金免疫标记培训班资料7并借助离心来判断。2．有些蛋白最佳pH范围较窄，设置的梯度不能太大。5、最小蛋白浓度的确定(1)用0.22m微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体；(2)取一96孔滴定板，每个重复为若干个孔，分别加入最佳pH的胶体金100l，重复3次；(3)各孔依次加入不同量的蛋白（一般浓度为0.05-0.1mg/ml）1～20l，混匀，室温下放置15min；(4)加入20l10％NaCl，室温下放置10min；(5)颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。(6)为确保结果准确性，可放大反应体积重复以上步骤。注：在实际探针制备工作中，蛋白浓度往往为最小浓度的130％。6、IgG-gold的制备