温度验证培训教程

上海严复机械科技有限公司版权所有温度验证培训教程药源社区特别版上海严复机械科技有限公司月上海严复机械科技有限公司版权所有第一节什么是验证？为什么要验证？工艺验证与产品验证的区别第二节设定验证合格标准时，应遵循哪些原则？第三节热力灭菌的基础知识○灭菌程序的验证是无菌保证的重要内容○灭菌程序的设计原则○热力灭菌动力学基础○影响灭菌的效果○热力灭菌机理○对数规则的数学模式○灭菌工艺有关参数及相关性○不同灭菌工艺的无菌保证能力○生物指示剂第四节灭菌程序的热力学验证○高压灭菌器中的蒸汽灭菌验证○干热灭菌和去热原的验证第五节注射剂无菌保证工艺研究与验证常见技术问题第六节验证报告实例（供参考）上海严复机械科技有限公司版权所有第一节什么是验证？为什么要验证？工艺验证与产品验证的区别验证的定义是：“验证就是为了提供有依据的保证取取得充分的证据，并把这些证据编制成正式文件，以证明所考察的工艺在做（或将要做）规定他所要做的，同时验证也取得了现有的科学地位。”我国《药品生产质量管理规范》（98年修订本）在第十四章第八十五条将验证定义为“证明任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统确实能导致预期结果的一系列活动。”可见，验证是药品生产及质量管理中的一个全方位的质量活动，它是实施GMP的基础。验证是制药企业定标及达标运行的基础，验证文件则是GMP的重要证据。有三个理由能说明为什么制药企业如此关心他们的生产工艺是按规定要求始终如一地得到贯彻执行：1．政府规范2．质量的保证3．降低成本工艺验证与产品验证的区别：1．工艺验证是按照书面的验证方案，对相应产品的关键工序或关键工序的关键数据进行验证，应设定不同的情况，有一点点类似于我们常说的工艺摸索。工艺验证的基础或者说依赖于产品开发报告。国际认证这方面的这方面的文件查看的严一些，国内检查认证时基本不看，所以大家以为不存在这样的文件，产品开发报告实际就是开发阶段的数据汇总和分析总结。工艺验证是局部的，是产品验证的基础和前提。2．产品验证(试产)应该是按照工艺规程(已根据工艺验证进行了完善和补充)，按照正常的生产操作生产三批产品（昀少是3批，因为这是统计学具有统计意义昀低的批次数量）。在我国的GMP(包括动物药、人药、保健食品、药包材)认证中，两者是没有完全分清楚的，称为产品工艺验证比较好。产品验证是对于一个产品全部工序的验证，是所有验证的昀后一个工作。3．应分清楚工艺规程与产品工艺验证的关系：到底先有谁？因为在药物研发中，就有工艺的摸索，工艺规程写出来后，又需根据工艺验证的数据及结果进行修改。所以，在生产企业里，先是根据相关资料(药典、其他质量标准、相关参考文献、研发资料)写一个工艺规程，然后做工艺验证，再修改工艺规程。这是对于新产品而言，如果对于老产品，工艺已经比较成熟了，只需说工艺验证结果完全符合要求，就不需修改工艺规程。4．在国内，很多工艺验证没有单独列出来，一般都放在设备的性能确认里面了。进来看一些国际方面的培训资料，认为设备验证只是包括设计确认、安装确认和运行确认；而性能确认是设备＋物料＋工艺三者的结合，不能放在一起。还有人认为性能确认放在设备验证还是单独列出，不是关键，关键是真实的做，做法科学合理。第二节设定验证合格标准时，应遵循哪些原则？1．凡我国《规范》及药典有明确规定的，验证合格标准不得低于法规的要求及设计标上海严复机械科技有限公司版权所有准。如企业设备或工艺确有其特殊性，需采用更适合本企业的方法，那就需要通过验证，用验证的数据来证明所采用方法的合理性。2．我国尚无法确定标准而WHO、GMP已有明确要求或国际医药界已有公认惯例的，可作为本企业设定验证标准的参考依据。在可能的条件下在验证中采用国际通用的标准是明智的选择。3．从全面质量管理的观念出发来设定验证方案及有关标准。在许多情况下，特别是管理方面的标准、合格标准难以量化，难以从现成的资料上去寻找制订标准的依据。企业应从验证的内涵上，从全面质量管理的观念出发，根据工艺、设备及人员的实际情况自行设定标准。第三节热力灭菌的基础知识○灭菌程序的验证是无菌保证的重要内容。USP24在1211药品的灭菌和无菌保证中非常明确地阐述了灭菌程序的验证的原则及要求。使用未经验证的灭菌程序，就谈不上产品的无菌保证。要想使一个灭菌设备在受控的验证状态下运行，必须从分了解微生物学和工程学方面的基本原理；设备的设计、安装、运行都必须合理、恰当。必须通过科学的试验，用数据来证明设备的运行不但稳定，而且可靠。以早期的工艺设计到验证的实施和监控的所有文件记录，均应归档保存。只有对灭菌设备的运行相关的电气、机械以及物理操作等全面了解后，才能着手该设备的验证。对上述资料的充分了解，是撰写验证方案和标准操作规程的先决条件。这对拟定校验和维修计划、指定在验证方案，确保设备运行始终处于受控状态下是十分有益的。○灭菌程序的设计原则在制药工业，热力灭菌程序需要根据药典通则，GMP的要求及被灭菌品的特点来设计。在设计灭菌程序时，应当考虑被灭菌产品的完整性，稳定性。无菌保证及经济性等多方面因素。灭菌时间和温度的决定，在保证达到无菌要求的同时，还应防止灭菌时间过长或温度过高，造成产品降解。总之，灭菌程序的设定应兼顾无菌保证、产品降解、容器/密封完好性及整个贮存有效期内的稳定性要求。○热力灭菌动力学基础热力灭菌是研究昀深、使用昀广的灭菌方式。当温度超过细胞昀佳生理活动的温度范围时，随着温度升高，细胞代谢减慢，细胞的生长及繁殖昀终停止。每种细胞的生理活动的温度均有一上限，一旦温度超过了它的上限，起生命作用的蛋白质、酶及核酸会被永久性破坏，从而导致细胞发生不可逆转的死亡。从微观上看，不具备真正核膜结构的原核细胞（如细菌和蓝藻耐热性昀强。某些嗜热性细菌甚至可在80℃以上的高温中存活。但大多数生长态菌在80℃－100℃以下即可被迅速杀灭。具备核膜结构的真核微生物，如真菌和原生动物，在60℃－80℃就可被迅速杀灭。多数病毒耐热性较差，只有HBV(乙肝病毒)除外，它要在75℃下至少曝热3min才能被灭活。还有一些其他类型的生物体也具有较强的耐热性。而在细菌中，需氧菌中的芽孢杆菌属和厌氧菌中的梭状芽孢杆菌属，也具有较强的耐热性。这些细菌的细胞能产生内源性孢子（芽孢）或胞间休眠体，一旦形成这种状态，它们对热、干燥及化学消毒剂的耐受性增强。想要杀灭这类芽孢，使之下降一个数量级（对数单位），干热灭菌必须达到100℃－170℃，湿热上海严复机械科技有限公司版权所有灭菌的温度在80℃－129℃之间。如以干热灭菌及湿热灭菌的灭菌率L（Lethality）来计算，芽孢被杀灭的困难程度比其生长态时增大了104－105倍。○影响灭菌的效果1.物理/化学因素在细菌形成芽孢的过程中的多种环境因素会影响孢子的耐热性。例如，温度较高并有二价阳离子（如Ca2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+）存在时，芽孢的耐热性增强；于此相反，当PH超过6.0－8.0的范围时，或在高浓度盐水或磷酸盐中形成芽孢时，其耐热性下降。自然界中的芽孢耐热性与环境条件相关，如溶液、浓度、水分（相对平衡湿度）、PH、对芽孢有损伤作用的物理因素以及对芽孢有抑制作用的化学品等，他们均会影响芽孢的耐热性。包藏在晶体或者有机物内的芽孢，其耐热性通常明显高于一般非包藏状态的芽孢。因此，在某一温度条件下，将泥土包藏性芽孢和泥土分离并培养得到的芽孢同时灭菌时，要想获得相同的灭菌效果，同意灭菌温度下，前者所需的灭菌时间比后者要高出十多倍。由于被灭菌品受到了其他物品接触遭到了污染时，要将芽孢完全杀灭会很困难，正因如此，GMP要求采取一切必要的措施防止污染。2.相对湿度在热力灭菌中，水对杀灭细菌芽孢起着重要作用。与水相关的灭菌方式只有两种：湿热和干热。湿度达到饱和[相对湿度（RH）为100%或aw=1.0]时的灭菌方式称为湿热灭菌；相对湿度低于100%条件下的灭菌方式统称为干热灭菌。实验室数据表明，湿度在90℃－125℃之间，向度湿度在20%－50%时，细菌芽孢较难杀灭；当相对湿度高于50%或低于20%时，则较易杀灭。3.曝热时间灭菌过程中，原核细胞的死亡（被杀灭）遵循一级反应的规则。温度与某一时间芽孢存活对数间关系，在许多情况下呈线性。这就是说，在特定的灭菌温度下，任一时间孢子死亡仅与这个时间孢子的浓度相关，而使孢子数下降一个对数单位所需的时间并不受孢子原浓度影响。○热力灭菌机理组成细胞的蛋白质分子的功能取决与它的特殊结构，在一定高温条件下受热时，蛋白质分子内氢键发生断裂影响了分子空间构型的重排，从而导致了微生物的死亡。对这一课题进行大量的研究表明，细菌孢子，尤其是芽孢杆菌和梭状芽孢具有耐热性。耐热孢子的破坏取决于在水分条件下孢子的水合作用以及核酸和蛋白质的变性。因此，蒸汽灭菌中使用饱和蒸汽是至关重要的。饱和蒸汽的穿透性比干热空气及过热蒸汽的穿透性要强得多。蒸汽冷凝时放出的潜热（2.27KJ/g）传达被灭菌品，使之升温并使被灭菌品所带的微生物尤其是表面微生物发生水合作用，从而加速了它们的死亡。○对数规则的数学模式长期以来，人们进行了大量的探索及研究工作，以解决蒸汽灭菌的无定量标准的难题。研究的对象主要是耐热孢子因为生长态菌在灭菌过程中很容易被杀灭。研究的课题是在蒸汽灭菌过程中，微生物的死亡（被杀灭）所遵循的规律。研究的结果表明，将活的微生物看做反应物，并将杀灭后的微生物看做生成物，孢子的死亡基本符合质量作用定律。因为这一研究以阿伦泥乌斯一级反应为基础，故被认为是经典理论。上海严复机械科技有限公司版权所有湿热灭菌的对数规则始于1921年Bigeiw发表的论文－――用对数规则阐述灭菌工艺过程，Rahn等人对此进行了详细的研究，使对数规则更系统化了。按照他们的理论，灭菌时微生物的死亡遵循对数规则。根据质量作用定律，在恒定温度及保持其他条件不变的情况下，单位时间内被杀灭的微生物数正比于t0时的原有数目，即dN/dt=k(N0－Nk)○灭菌工艺有关参数及相关性1.D值（微生物耐热参数）指一定温度下将微生物杀灭90%或使之下降一个对数单位所需的时间（单位：分钟）。D值的大小直观地反映了微生物的耐热受性。（图1，D值示例）（图2，温度对D值的影响）2.Z值（灭菌温度系数）指某一微生物的D值变化一个对数单位，灭菌温度应升高或下降的度数。上海严复机械科技有限公司版权所有Z值被用于定量地描述孢子对灭菌温度变化的敏感程度，Z值越大，孢子对温度变化的敏感性就越弱，此时，企图通过升高灭菌温度的方式来加速杀灭微生物的收效就不明显。Z值在湿热灭菌时，取10。灭菌温度系数Z值在干热灭菌，灭菌时取值为20℃，在去除热原时，Z值取值为54℃（GMP验证指南2003P319）。这里需要额外说明的是根据弗里德里克·卡利登[美]和詹姆斯·艾盖洛克所著的《无菌工艺的验证》233-235页中述及的去热原时Z值标准为46.4，{引自Tsuji,K.,AndHarrison,S.1978.Dryheatdestructionoflipopolysaccharide:Dryheatdestructionkinetics.Appl.Environ.Microbiol.36(5):710-714}。由此所得到的FH值与目前国内GMP验证规范的方法与要求略有出入，请根据各企业的实际要求选择。附表Z值取46.4时各温度的FH值。(时间：1分钟)温度2046.446.4℃FH170FH170FH2501701.01.00.02210100.07.30.1425010000.053.01.0270100000.0142.02.7假设周期为250℃，30分钟，整个周期的FH昀小值将为：温度2046.446.4℃FH170FH170FH2502503000001590.030.03.FT值（T（℃）灭菌时间）FT值指T（℃），系指一个给定Z值下灭菌程序在温度T（℃）下的等效灭菌时间。FT=DT.△lgN式中，DT为在T（℃）下微生物的D值；△lgN为T（℃）下灭菌程序使微生物下降的对数单