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PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材1|页PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材FlexarLC-Chromera美国珀金埃尔默仪器美国珀金埃尔默仪器美国珀金埃尔默仪器美国珀金埃尔默仪器（（（（上海上海上海上海））））有限公司有限公司有限公司有限公司PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材2|页内容第一部分：液相色谱基本工作原理及基本知识第二部分：液相色谱仪标准化操作流程SOP第三部分：液相色谱软件（Chromera）操作第四部分：液相常见问题第一部分：液相色谱基本工作原理及基本知识液相色谱工作原理：是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase),即色谱柱；有一相是流动的,称为流动相(MobilePhase),流动相又叫洗脱剂或溶剂。液相色谱仪实际照片如下：图1-1常见配置FlexarLC高效液相色谱仪外观泵泵泵泵柱温箱柱温箱柱温箱柱温箱自动进样器自动进样器自动进样器自动进样器紫外检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器溶剂管理系统溶剂管理系统溶剂管理系统溶剂管理系统PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材3|页溶剂溶剂溶剂溶剂(流动相流动相流动相流动相)泵泵泵泵进样器进样器进样器进样器色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱(固定相固定相固定相固定相)检测器检测器检测器检测器废液废液废液废液数据系统数据系统数据系统数据系统图1-2高效液相色谱仪系统示意图图1-3样品组分分离示意图PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材4|页1.1.1.1.液液液液相色谱在各个行业的应用相色谱在各个行业的应用相色谱在各个行业的应用相色谱在各个行业的应用在医药行业:药物中有效成分的含量、相关物质分析、药代分析、药物中间体的分析等；在环境保护工作中:可用来监测土壤,大气和水的质量；在食品工业中：可用于各种营养成分、非法添加剂、兽药、农药等的监控分析；在农业上可用来监测农作物中残留的农药；在石化上可用于各种添加剂、高聚物分子量等测定；生命科学上用于氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等的分析；在公安用于鉴别药物中毒或毒品类型.2.2.2.2.液液液液相色谱的各个组成部分相色谱的各个组成部分相色谱的各个组成部分相色谱的各个组成部分由以下五大系统组成：高压色谱泵、进样器、色谱柱、柱温箱、检测记录系统。组分能否分开，关键在于色谱柱；色谱泵以恒定流速驱动流动相进入色谱柱从而保证了色谱分离的过程，所以色谱柱和色谱泵是液相色谱仪的核心。2.1部分：色谱泵专利的设计专利的设计专利的设计专利的设计————溶剂自动补偿溶剂自动补偿溶剂自动补偿溶剂自动补偿Flexar系列泵是目前世界上唯一能自动进行溶剂压缩性补偿的传输泵，能自动记录并计量在混合过程中由于溶剂体积收缩而出现的任何量的变化。当溶剂压缩性改变时，系统将立即发生作用并自动予以调整。专利的设计使得每次泵冲程中的任何溶剂混合都能进行自动溶剂补偿，因此，Flexar系列泵混合流动相和人工预混合所得出的分析结果基本一致。独特的设独特的设独特的设独特的设计计计计双柱塞正压吸入式恒流泵，使吸液过程在正压下进行，从而避免负压吸入空气的可能性，泵内不易产生气泡。最优的耐压性能最优的耐压性能最优的耐压性能最优的耐压性能全流速范围0~10mL/min，均可耐压至6100psi。图1-4FlexarLC色谱泵结构示意图PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材5|页2.2部分：进样器分手动进样器和自动进样器两种图1-5Flexar自动进样器外观（左）及内部图图1-6六通阀工作示意图图1-6手动进样器六通阀横剖面图PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材6|页手动进样器使用注意事项：手柄不能停留在Load和Inject中途！否则会暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀。在HPLC系统中使用平头注射器针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；也防止了针头刺坏密封组件及定子。过滤样品溶液，防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗；进样前，用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。2.3部分：色谱柱是液相色谱分离的核心，也是液相色谱系统中最常用的消耗品之一。在使用色谱柱之前，一定要先仔细阅读色谱柱的说明书(不同的色谱柱，使用要求差距很大)！不当的使用会严重缩短色谱柱的寿命！任何色谱柱都有液体流动方向，不能反用!最常用的BrownLeeC8、C18反相色谱柱通常使用要求：流动相的pH范围：2.5~7.5；使用温度：80℃以下；操作压力：小于4000psi;保存溶剂：100%甲醇。表1-1色谱柱直径与最佳流速关系色谱柱直径最佳流速1.0mm50uL/min2.1mm200uL/min3.2mm500uL/min4.6mm1.0mL/min图1-7BrownLee色谱柱的实物图注意：图中色谱柱方向的箭头，色谱柱不能反方向使用！PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材7|页2.4部分：检测系统经过分离的组分要选择合适的检测器，才能得到检测。Page38液相常用检测器液相常用检测器液相常用检测器液相常用检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器UV示差检测器示差检测器示差检测器示差检测器RI荧光检测器荧光检测器荧光检测器荧光检测器FL电导检测器电导检测器电导检测器电导检测器CD测量参数测量参数测量参数测量参数吸光度吸光度吸光度吸光度（（（（AU））））折光指数折光指数折光指数折光指数（（（（RIU））））荧光强度荧光强度荧光强度荧光强度（（（（AU））））电导率电导率电导率电导率（（（（uS/cm））））池体积池体积池体积池体积/ul1～～～～103～～～～103～～～～201～～～～3类型类型类型类型选择性选择性选择性选择性通用性通用性通用性通用性选择性选择性选择性选择性选择性选择性选择性选择性线性范围线性范围线性范围线性范围105104103104最小检出浓度最小检出浓度最小检出浓度最小检出浓度/(g/ml)10-1010-710-1110-3最小检出量最小检出量最小检出量最小检出量1ng1ug1pg1mg噪声噪声噪声噪声10-410-710-310-3用于梯度洗脱用于梯度洗脱用于梯度洗脱用于梯度洗脱可以可以可以可以不可以不可以不可以不可以可以可以可以可以不可以不可以不可以不可以对流量敏感性对流量敏感性对流量敏感性对流量敏感性不敏感不敏感不敏感不敏感敏感敏感敏感敏感不敏感不敏感不敏感不敏感敏感敏感敏感敏感对温度敏感性对温度敏感性对温度敏感性对温度敏感性低低低低10-4C低低低低2%/C还有比较新的还有比较新的还有比较新的还有比较新的蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器ELSD3色谱常用定量方法3.1校正因子的概念校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。可用下式表示：Mi–I组分的量；fi–I组分的校正因子；Ai–I组分的峰面积定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大误差。故引入校正因子。3.2外标法（ExternalStandard)在相同分析条件下，通过比较标准物质与样品的色谱峰面积或峰高,获得定量结果的计算方式.a.用已知的标准品配成不同浓度的标准样，测量各种浓度的峰高或峰面积，绘制响应信号与百分含量的关系曲线；iiiAfm⋅=PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材8|页b.测量样品的峰面积或峰高，在校正曲线上查出其对应的百分含量。外标法定量的具体过程请参考图1-8。整个数据处理过程可以通过PerkinElmer的色谱工作站完成。c.要求：进样量、色谱分析条件严格不变；4液相色谱样品的制备液相样品制备的基本原则：a溶样溶剂一定是初始比例的流动相(对等度试验而言，就是流动相)，否则会有溶剂效应或由于样品在流动相中溶解度不同而析出固体堵塞色谱柱。当然经过实验考察和证明，其他溶剂也可代替。b采用以下一种或几种处理方式去除样品中的不溶物和色谱干扰物：①高速离心(大于10,000rpm)10分钟后，取上清液②过滤、超滤③选择性沉淀④衍生反应⑤液-液萃取⑥固相提取(SolidPhaseExtract,SPE)⑦其它图1-8外标法定量过程0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样样样样样样样样样样样样样样样样响应值峰面积()01234增加溶质的浓度工作标样储存标样上机测试标液根据标样的色谱峰面积绘制标准曲线配置不同浓度的标液05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样样样样样样样样样样样样样样样样响应值峰面积()样品的峰面积样品的峰面积样品的峰面积样品的峰面积样品的浓度样品的浓度样品的浓度样品的浓度根据样品的峰面积计算浓度PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材公司液相色谱现场培训教材9|页第二部分：液相色谱仪标准化操作流程SOP1开机及准备系统2实验打开计算机，运行Chromera软件，在手动控制manualcontrol界面下，设定试验所用的流动相条件、检测波长和其他参数，观察基线，待基线平稳，可准备进样，运行序列sequence。具体软件操作，请参考第三部分液相色谱软件（Chromera）操作。3关机实验结束后，返回手动控制manualcontrol界面下，依次进行以下操作：1.清洗色谱柱约60分钟（详见附录一详见附录一详见附录一详见附录一）2.冲洗进样器（详见详见详见详见1.4）3.降低流速至0，待系统压力回零后，退出Chromera软件，关闭液相各个模块电源。关闭计算机及显示器电源。准备溶剂准备溶剂准备溶剂准备溶剂详见详见详见详见1.2执行泵灌注执行泵灌注执行泵灌注执行泵灌注详见详见详见详见1.3冲洗进样器冲洗进样器冲洗进样器冲洗进样器详见详见详见详见1.4开机自检开机自检开机自检开机自检详见详见详见详见1.1放入样品盘放入样品盘放入样品盘放入样品盘详见详见详见详