核磁共振应用

作者简介：刘畅（1989－），女，吉林长春人，硕士，研究方向为环境微生物学。核磁共振技术原理及其在蛋白质研究中的应用刘畅（桂林理工大学环境科学与工程学院，广西桂林541006）摘要：核磁共振(NMR)是一种不破坏样品的无损伤分析技术,是分子结构分析不可或缺的手段。随着新技术、新方法的不断发展,其研究领域和应用范围已扩展到了几乎所有的自然科学领域。文章简要叙述了核磁共振技术的基本原理，以及其在蛋白质研究中的应用。关键词：核磁共振；蛋白质；结构解析中图分类号：Q71文献标识码：A1引言核磁共振波谱(nuclearmagneticresonancespectroscopy,NMR)是分子结构分析中一种重要的波谱学研究手段,它能够提供原子水平的分子平面和立体结构,以及动态信息[1-3]。自1945年观察到凝聚态物质的NMR现象之后,经过60多年的发展，NMR的研究领域和应用范围已经从物理学延伸到化学、生物学、医学、材料科学、信息学等几乎所有自然科学领域。先后有5次诺贝尔奖授予了核磁共振研究工作者,其中物理学奖两次(Rabi,1944年;Bloch和Pur-cell,1952年),化学奖两次(Ernst,1991年;Wthrich等,2002年)，生理和医学奖一次(La-uterbur和Mansfield,2003年）。NMR在生物学领域的应用最为广泛也最受关注，与其他分析技术相比，核磁共振技术具有以下几个特点：（1）无损伤性，不破坏样品的结构和性质，无辐射损伤[4]；（2）不需提取分离或只需简单预处理即可同时测定多种成分；（3）实验方法灵活多样。[5]经过二十多年的发展，核磁共振技术已经发展成为除X射线晶体衍射技术之外另一种可行的确定蛋白质空间结构的方法。由于其测试灵敏、技术方法齐全，在表征抗原抗体反应的微观结构上有着广泛的运用，并在蛋白质领域得到迅速发展[6-8]。2核磁共振技术原理核磁共振光谱和传统的光谱有一定的相似性,传统光谱为电子吸收能量从基态跃迁到激发态，而核磁共振光谱则是原子核吸收了能量从基态跃迁到激发态。有所不同的是核磁共振光谱需要将样品置于外磁场中才能够使得原子核裂分出两个到多个能级,改变了外加磁场的场强，就改变了原子核的特征频率。另外核磁共振激发态的寿命是电子激发态寿命的109倍，更长的寿命使得谱图的线宽更窄，使得吸收能量的过程中核自旋的微小差异都可以被观测到，同时长时间处于激发态也使得能量能够从一个核自旋传递到另一个，使得多维核磁实验成为可能，最后长寿命的激发态使核磁共振光谱在分子动力学测量上能够具有很宽的可供研究的时间度。[9-10]在液体核磁中，样品管被放置在外强磁场Bg中,NMR可检测的原子核磁距沿着磁场的Z方向有序的排列。在外磁场作用下，核磁距转到x、y平面,核磁距进行拉摩进动。由于局部磁场的扰动，样品中的原子核以各自不同的速率进动。这些扰动受蛋白质结构、侧链带电性、芳香环电流、化学键的扭角和氧键结合的影响。原子核磁矩u和自旋角动量P之比为一常数：huNgNmPgNePu/2//—称为磁旋比；h是普朗克常数；m是原子核的磁量子数。与核的质量、所带电荷以及朗德因子有关。是原子核的基本属性之一。不同的原子核的值不同，核的旋磁比越大，核的磁性越强，在核磁共振中越容易被检测。下表1是一些常见核的性质。表1几种核的性质[11]同位素I天然丰度（%）u710/绝对灵敏度共振频率（MHz）/B=7.0463T1H1/299.982.7926.751.003002H10.0150.861.45*10-646.0513C1/21.110.406.731.76*10-475.4314N199.630.401.01*10-321.6715N1/20.37-0.28-2.741.85*10-630.4019F1/21002.6325.180.83282.2331P1/21001.1310.846.63*10-2121.40图1核的进动拉摩进动：当磁核处于一个均匀的外磁场Bo中，核因受到Bo产生的磁场力作用围绕着外磁场方向作旋转运动，同时仍然保持本身的自旋。这种运动方式称为进动或拉摩进动(Larmorprocess)，它与陀螺在地球引力作用下的运动方式相似。如图1所示。3核磁共振在蛋白质研究中的应用蛋白质在稀溶液状态下，可通过核磁共振技术得到反应位点的NMR参数来决定蛋白质的三级结构。这些参数包括弛豫时间(relaxation)、化学位移(chemicalshift)、自旋祸合(spincoupling),NOE效应(nuclearoverhausereffect)、磁化量转移(magnetizationtransfer)、自旋标记(spinlabeling)等[12-13]。采用NMR法研究蛋白质存在着3个主要问题：①待测蛋白质存有一定分子质量上限(随着分子量的增加，信号急剧重叠)；②测量灵敏度随着横向弛豫时间加快而降低;③蛋白质的NMR结构分辨率能否达到与X射线晶体结构相似的水平[14-15]。对于结构测定的蛋白质而言，分子量越低，干扰越少，结构特征也越容易判断。由于核磁共振技术本身的制约，限制了其研究对象—生物大分子的分子量。二十世纪末，测量得到NMR结构的绝大多数蛋白质分子量都在10X103以下。近年来随着核磁共振技术的发展，溶液结构的测定已经应用于分子量为25X103以上的蛋白质。3.1蛋白质溶液的结构解析蛋白质是生命活动的主要承担者，其生物功能主要由三维结构决定。全面了解蛋白质等生物分子的精细三维结构是在原子分子水平上研究生命活动的基础，也是蛋白质科学的核心研究内容之一。只有在确切地知道了蛋白质三维结构的基础上，才能对蛋白质的功能和作用机制有更全面的了解。蛋白质中有相当一部分(约20%)由于得不到单晶,无法用X射线衍射技术测定。更为重要的是液态蛋白质结构更接近蛋白质在生物体内的状态。截止到2005年11月29日在PDB()数据库中总共30995个蛋白质(包括肽和病毒)中有4332个是由NMR获得的，约占14%。蛋白质三维结构测定所需的样品要经过基因工程表达(包括自旋标记)、化学分离和纯化，根据所用测定方法的需要制备成不同形态的样品。通过NMR实验收集一系列多核多维谱，进行谱峰归属，判别NMR信号与蛋白质所含各核的对应关系，根据这些信息,提取结构约束参数，再运用分子动力学计算获得蛋白质的三维结构图像。这其中每一个环节的进步和发展，无不涉及多个学科知识的综合运用。[16-17]图2蛋自质的一维1H-NMR谱图.分子量分别为(a)5kDa和(b)32kDa图2是蛋白质的一维1H-NMR谱图，分子量分别为5kDa(见图2(a))和32kDa(见图2(b))。分了量增大明显降低了NMR谱图的分辨率，仅用1H谱不能解析生物大分子的信号，这是因为1H谱的化学位移范围比较狭窄(～15ppm)，NMR信号易于重叠，而大多数蛋白质样品的13C和15N谱宽分别为200ppm和30ppm左右，信号更加分散。因此，分子量超过5kD的蛋白质测定溶液结构一般都需要进行同位素标记，即对蛋白质分了中的13C、15N核进行同位素富集.蛋白质同位素标记技术是研究大分子蛋白质NMR结构的前提。加拿大多伦多大学就组织了结构基因组前沿课题,他们将同位素标记的热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)基因组编码蛋白质分到几个NMR小组,同时进行数据收集和结构分析。最终在一年内得到了十几个三维结构[18]。MargaretA.Johnson等利用转移NOE(transferNOE)实验和饱和转移差谱(saturationtransferdifference,STD-NMR)分析了稀溶液中八肤片断的抗原决定簇以及抗Shigellaflexneri上的多糖O-抗原抗体的3D结构[19]。结果表明，溶液中立体结构和晶体结构有很好的相关性，但抗原抗体复合物在溶液中的立体结构和晶体结构略有不同。3.2核磁共振在蛋白质动力学方面的研究在研究蛋白质的动力学方面，核磁共振技术与其它分析技术相比，具有很大的优越性，即可以在比较接近生物大分子生理环境的条件下对其进行研究，因而得到的结果更具有说服力。NMR法通过测定大分子的弛豫时间，即纵向驰豫时间(T1)、横向弛豫时间(TZ)和异核的NOE效应(nuclearoverhausereffect)，研究一定时间范围内的化学反应和构象转变的动力学过程。NMR谱峰的宽度或裂分程度反映自旋核的快交换和慢交换过程。磁化量转移(magnetizationtransfer)对于研究蛋白质折叠和构象变化有较大帮助，同时可以对化学交换反应动力学和肤链二级结构进行研究。图4双结构域蛋自质PDZ1-2通过结构和动力学重组来调控与配体(cypin肽段)的相互作用蛋白质复合物在行使功能时，有一个相互接触、结构变化、继而分离的过程，因此，生物体内弱的、暂态的相互作用非常普遍，结构域之问的相对运动显得尤为重要。PDZ1-2是NMDA受体信号传导通路中的骨架蛋白PSD-95的N端PDZ结构域串中的前两个结构域。这种多结构域的蛋白质在信号通路和离了通道中极为普遍。这些蛋白质都很大，通常采用“各个击破”的策略，逐一研究单个结构域的结构和功能。PSD-95的PDZ1和PDZ2相对较小，是研究结构域之问协同效应的理想模型。PDZ1-2的三维溶液结构和动力学的NMR研究表明[20],PDZ1和PDZ2的孤立结构与其在PDZ1-2中的结构差别不大.它们与配体(cypin肽段)形成复合体后，无论单独形成的复合体，还是共同形成的复合体，都能引起结构的变化，而且结构变化的程度也基本相同。3.3蛋白质与配体的核磁共振研究蛋白质与蛋白质之间,蛋白质与其它生物分子(如DNA、RNA、多糖、药物)之间的相互作用或结合是完成生命活动的主要途径。由于结合态与游离态的配体分子中原子核自旋的核磁共振参数(化学位移、弛豫时间和扩散系数等)存在有较大差异,因此可通过NMR得到蛋白质结构变化的动力学信息,这对于药物的设计和筛选优化是非常有用的。而且NMR所研究的是在接近生理环境下的液态蛋白质的动力学性质,所得到的结果更具有说服力。如当核苷酸结合于叶绿体ATP合成酶时,酶蛋白的两个共振峰2.70ppm(Asp-BH)和2.29ppm(Glu-CH)的横向弛豫时间T2缩短,表明这两个质子的运动性(Mobility)减少[21]。4结语在过去的15年中，研究蛋白质动力学的NMR核自旋弛豫实验技术和理论方法得到很大发展。这些方法的应用范围也得到很大扩展，包括蛋白质在各种生物功能状态下的多个时间尺度的构象动力学，从而可以表征蛋白质的折叠、稳定性和生物活性等。近年内发展蛋白质侧链动力学的NMR技术仍是研究热点。目前蛋白质核磁共振研究面临的两大挑战是突破分子量上限和提高测定速率.当蛋白质分了量增大时，共振峰的数目随之增多，谱峰重叠的儿率相应增加，需要更高的分辨率加以区分。NMR谱仪硬件技术和实验技术不断面临着挑战，高灵敏度和高分辨率NMR实验方法研究一直备受关注，并期待出现重大突破。参考文献：[1]庄华梅，何德．核磁共振技术及其在生命科学中的应用[J]．生物磁学，2005，5(4)：58－60．[2]TomesJC，GuixeV，．BabulJ．Biochem,1997，327：675－684．[3]maaheimuH，FiauxJ．CakarZP，etal．EurJBiochem．2001，268(8)：2464－2479．[4]武汉大学化学系．仪器分析．北京：高等教育出版社[M]，2001：184．[5]刘玮，林健强，刘相梅，等．核磁共振技术在微生物代谢研究中的应用[J]．微生物学通报，2007，34(1)：157－160．[6]WiithrichK．NMRofProteinsandNu-cleicacids[M]．NewYork：AWiley-intersciencePublication，1996：117．[