第七章 免疫沉淀技术

免疫沉淀技术免疫沉淀技术一.免疫沉淀反应定义二.免疫化学基础三.免疫沉淀技术分类四.免疫沉淀技术的应用免疫沉淀技术一.免疫沉淀反应定义二.免疫化学基础三.免疫沉淀技术分类四.免疫沉淀技术的应用免疫沉淀反应可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现的蛋白质析出现象。与凝集反应、中和反应、补体参与的抗原抗体反应并称经典免疫学技术免疫沉淀技术一.免疫沉淀反应定义二.免疫化学基础三.免疫沉淀技术分类四.免疫沉淀技术的应用沉淀反应原理沉淀原（precipitinogen）沉淀素（precipitin）抗原抗体间的力1.疏水性的改变2.电荷的改变3.分子量及结构的改变沉淀的发生抗原的价抗体的价IgG、IgA、IgD和IgE类抗体：两价分泌型IgA：四价IgM类抗体：十价亲和力和亲合力affinityavidity抗原抗体反应的特异性特异性的物质基础epitope交叉反应交叉反应的物质基础1.抗原异质性（antigenheterogeneity）2.共同抗原决定簇（commonantigenicdeterminant）3.决定簇相似共同抗原的类型1.同种抗原2.嗜异性抗原（又称Forssman抗原）抗原抗体反应的最适比例抗原抗体反应的阶段性1.抗原抗体结合阶段2.抗原抗体反应阶段抗原抗体反应的影响因素1．中性盐的作用2．pH3．温度4．离子强度中性盐的作用加入高浓度盐（如硫酸铵）以脱水，或者用分子量大约6000，浓度3～4%聚乙二醇（PEG6000），以其多聚物孔隙排阻脱水来大大降低抗原抗体复合物的溶解度。pH值尽可能调节pH至复合物的等电点附近，通常此pH值是介于IgG等电点（约pH=7）和抗原等电点之间，也依赖于抗原与抗体的比例。温度温度与抗原抗体反应有密切的关系温度升高可促使分子运动加快，抗原与抗体碰撞机会多，容易结合，但也容易再解离;温度低，分子运动慢，撞击机会少，但一旦结合后则不易再分开。离子强度（1）有利于抗原抗体结合的条件：中等或较低离子强度（2）有利于抗原抗体解离的条件：高离子强度免疫沉淀技术一.免疫沉淀反应定义二.免疫化学基础三.免疫沉淀技术分类四.免疫沉淀技术的应用沉淀反应的种类1．溶液中沉淀反应2．凝胶中沉淀反应溶液中沉淀反应是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的抗原与抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。絮状沉淀试验康氏反应（Kahn‘stest）:心肌提取的类脂质抗原+反应素（Aegagin）敏感性高，特异性差，易出现假阳性。(1991年首批淘汰)性病研究实验室法(venerealdiseaseresearchlaboratory，VDRL)心拟脂及卵磷酯+反应素（Aegagin）不需加热的血清反应素试验(unheatedserumreagin)心拟脂及卵磷酯+氯化胆碱+反应素（Aegagin）反应最适比测定（1）抗原稀释法（Dean-Webb法）（2）抗体稀释法（Ramon法）（3）方阵法或棋盘格滴定法（checkerboardtitration）环状沉淀试验（ringprecipitationtest）Ascoli于1902年建立用于检查兽类内脏、毛皮浸液等标本中的炭疽杆菌抗原免疫比浊法（immunoturbidimetry）优点：校正曲线稳定，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染缺点：特异性、灵敏度稍差免疫比浊法的分类（1）透射比浊法（transmissionturbidimetry）（2）散射比浊法（nephelometry）（3）免疫胶乳浊度测定法（immunolatexturbidimetry）（4）速率抑制免疫比浊法（rateinhibitionimmunoturbidimetry）免疫沉淀技术（Immunoprecipitationassay）关键因素1.抗原的丰度2.抗体的结合能力3.蛋白和抗体的可接触性应用范围免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitationassay）结果分析NatImmunol.2008Apr;9(4):369-77.GSTPULLDOWN结果分析PNASFebruary26,2008vol.105no.82836-2841应用范围1.寻找新的相互作用蛋白2.验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用免疫共沉淀的局限性（1）难以检测低亲和力和短暂的相互作用（2）不能够确切分辨第三种蛋白的桥联作用（3）灵敏度不如亲和色谱高（4）需对未知蛋白的相关信息有一定了解基因转录调控染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀结果分析MolCancerTherJune2010vol.9no.61764-1774RNA免疫沉淀在生理状态下对结合在RNA上的蛋白质进行免疫沉淀，然后通过基因芯片或者其它手段检测目的RNA的含量。应用范围1.研究蛋白与DNA的动态作用2.研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的关系3.研究蛋白与RNA的相互作用免疫沉淀中抗体的选择免疫共沉淀技术的应用凝胶中沉淀反应以一定浓度（1～2%）的琼脂（或琼脂糖）凝胶作为介质，将抗原、抗体溶液分别放在琼脂凝胶板上并使它们彼此在凝胶中自由扩散，形成浓度梯度，当抗原与抗体相遇且比例适当时，在相应位置即可出现可见的沉淀环或沉淀线。沉淀线特点1.形成沉淀线的特异性抗原抗体无法通过沉淀线，只能在沉淀线周围形成沉淀2.与沉淀线无关的抗原和抗体分子则可以自由通过3.沉淀线的位置与抗原抗体的浓度和迁移率有直接关系单相免疫扩散试验（singleimmunodiffusion）双向免疫扩散试验（doubleimmunodiffusion）沉淀线分析ABCDEFAgAb沉淀线分析免疫电泳（immunoelectrophoresis）对流免疫电泳（counterimmunoelectrophoresis）火箭免疫电泳（rocketimmunoelectrophoresis）交叉免疫电泳（crossedimmunoelectrophoresis）免疫固定电泳（immunofixationelectrophoresis）首先将蛋白质抗原进行电泳分离，电泳后直接将抗体加于蛋白质区带表面，抗体与对应的抗原就会直接结合，形成的复合物嵌于固相支持物中。UrineImmunofixationElectrophoresis免疫印迹技术（immunoblotting）基本流程一．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）1.收集蛋白样品：贴壁细胞、组织、药物处理细胞2.蛋白质浓度测定：BCA3.电泳：10％分离胶、4％的浓缩胶4.电泳结果检查二.电转移毛细管印迹法和电泳印迹法转移膜的选择NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高高背景低较高低结合能力80－110ug/cm2400ug/cm2125－200ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿,避免气泡缓冲液润湿100%甲醇润湿检测方式常规染色，可用放射性和非放射性检测不能用阴离子染料常规染色，比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测适用范围0.45um一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中)糖蛋白检测和蛋白质测序价格价格较便宜便宜较贵基本流程三．酶免疫定位1.封闭：2.抗体的的选择：来源、标记、效价、二抗3.标记的选择：HRP、AP技术优势1.灵敏度高2.特异性高3.方法简便4.无需纯化5.易于观察、保存应用范围1.蛋白质相对含量检测2.蛋白质修饰水平分析3.蛋白质相互作用研究