线粒体-ros

活性氧与线粒体氧化损伤发布范围：公开2010-06-1020:39第9次课授课时间2010.1.11教案完成时间2009.12.11（教案续页）讲授与指导内容互动内容设计信息技术运用设计课时分配备注课程名称自由基生物学与医学年级2009年级专业、层次硕士研究生教员李文丽职务副教授授课方式（大、小班）小班学时3授课题目（章，节）ROS与线粒体氧化损伤基本教材(或主要参考书)《自由基医学》海春旭主编第四军医大学出版社教学目的与要求：1.理解线粒体氧化损伤的机制及其与疾病的关系；2.了解线粒体损伤的研究方法与干预策略。大体内容与时间安排，教学方法：1.介绍线粒体、复习线粒体的结构与功能20min多媒体+提问2.讲授活性氧损伤线粒体的途径与机制40min多媒体+讲授+图示3.介绍线粒体氧化损伤的研究方法与干预策略40min多媒体+科研实例展示4.小结10min启发科研思路5.提问与讨论10min课堂互动教研室审阅意见：（教学组长签名）（教研室主任签名）年月日本栏内，主要填写教员拟集中讲授的内容。操作办法：先将目前正在使用的教案电子版内容（40分钟）拷贝到这里，然后按照30分钟的讲授时间进行精炼，另外10分钟的内容纳入“互动内容设计”栏目。线粒体是真核细胞中最重要的细胞器，它是细胞有氧呼吸的主要场所，由内外两层脂膜围成，基质内含有线粒体自己的基因组(mtDNA)和细胞氧化代谢中必需的的酶和蛋白。线粒体内膜上的电子传递链的氧化磷酸化反应为机体提供ATP，是生命活动的主要能量和热量来源，因此线粒体被誉为细胞的“动力站”。在20世纪后半页，先后有五位科学家由于在线粒体生物能力学领域的重大发现而获得诺贝尔奖。近十多年来，人们还发现线粒体除了能量转换功能之外,还有其它多种极为重要的生理功能，包括生成活性氧自由基、调节细胞的氧化还原电势和信号转导、调控细胞凋亡和某些基因的表达等。由于线粒体在细胞凋亡中的关键性作用，因此线粒体又被称为‘细胞生存和死亡之马达’。当前，线粒体的研究已深入到生物的发育、代谢、衰老、疾病、肿瘤以及进化、遗传等众多重要领域，成为当前生命科学和分子医学中最活跃的新前沿之一。一、线粒体的结构线粒体是由双层单位膜套叠而成的封闭型膜囊结构。包括外膜：含多种转运蛋白，形成较大的水相通道跨越质脂双层。内膜：高度选择通透性，基粒具有酶活性，催化ADP磷酸化生成ATP，因此成为ATP酶复合体。基质：电子密度较低的可溶性蛋白质和脂肪等成分，mtDNA、核糖体、多种催化酶。线粒体DNA(mtDNA)是细胞核外遗传物质，其含量占整个细胞DNA的0.5%，在细胞能量转换中有十分重要的作用。化学组成与酶的定位1.化学组成水：酶促反应的诱剂、物理介质蛋白质：多数分布于内膜（60%）；分为可溶性的（基质酶、膜周边蛋白）和不溶性的（膜内在蛋白及酶蛋白）脂类：磷脂，3/42.酶的定位120多种酶外膜：合成线粒体脂类的酶，单胺氧化酶内膜：呼吸链酶系、ATP合成酶系；细胞色素氧化酶基质：酶混合物三羧酸循环反应酶系、丙酮酸与脂肪酸氧化酶系、蛋白质与核酸合成酶系二、线粒体的功能是细胞有氧呼吸的基地和供能的场所，供应细胞生命活动95%的能量线粒体的主要功能是把氧化各种底物产生的自由能转化为可被细本栏内，主要填写拟进行课堂互动的教学内容。共同复习线粒体的结构与功能2min启发式提问：为什么线粒体DNA更易受到自由基的损伤。2min启发式讨论：活性氧除了直接损伤线粒体外，还可以通过什么方式？2min启发式提问：大家所知道的哪些疾病可能与线粒体损伤相关？对应前两栏，填写拟采用的信息技术手段。多媒体图示图示动画图示过程多媒体多媒体多媒体10min病理照片对比显示说明图表显示概括图多媒体多媒体多媒体胞直接利用的形式——ATP细胞氧化（细胞呼吸）线粒体有氧呼吸：1分子葡萄糖→36-38ATP；无氧酵解：1分子葡萄糖→2ATP细胞氧化（细胞呼吸）的过程1.酵解（细胞质中）燃料分解：葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等能源物质在细胞质中无氧分解葡萄糖+2Pi+2ADP→2丙酮酸+2H2O+2ATP大量能量蕴藏在丙酮酸中2.乙酰辅酶A生成（线粒体基质）丙酮酸进入线粒体2丙酮酸+2HS-CoA→2乙酰CoA+2CO2能量转移至乙酰辅酶A3.三羧酸循环（线粒体基质）2min具体原因大家可以思考一下：D-半乳糖造成的氧化损伤的靶点主要不在生物膜？2min4.氧化磷酸化氧化磷酸化偶联机制可以综合为：1）NADH或FADH2提供一对电子，经电子传递链，最后为O2所接受；2）电子传递链同时起质子H泵的作用，在传递电子的过程中伴随H+从线粒体基质到膜间腔的转移；3）线粒体内膜对H+和OH-具有不可透性，所以随着电子传递过程的进行，H+在膜间腔中积聚，造成内膜两侧质子浓度差，从而保持一定的势能差；4）膜间腔中的H+有顺浓度返回基质的倾向，能借助势能通过ATP酶复合体F0上的质子通道渗透到基质中，所释放的自由能驱动F0F1ATP合酶合成ATP。三、活性氧（ROS）与线粒体损伤1.线粒体DNA突变线粒体是半自主性的细胞器，它涉及到两个彼此分开的遗传系统。随着人们对线粒体异常所引起的代谢紊乱研究的深入，发现：虽然呼吸链上90%的多肽是由核基因编码的但更多的代谢紊乱是由mtRNA突变引起的。线粒体DNA（mtDNA）是独立于细胞核染色体外的基因组，容易受到损伤，因此，发生突变的频率是核DNA的5-10倍。1）ROS导致线粒体DNA突变线粒体DNA(mtDNA)与核基因组DNA相比，更易受到自由基的损伤，这是因为：①mtDNA的位置靠近自由基产生部位——线粒体内膜，裸露于内膜上氧化呼吸链产生的大量自由基的环境中，易遭受氧化损伤。②mtDNA缺乏组蛋白的保护，并且因为缺乏修复系统，mtDNA损伤后不易被修复。③mtDNA不存在非编码区，氧化损伤造成的mtDNA的突变都被转录，所以损伤可以累积下来。当mtDNA发生突变时，细胞就成为包含有突变型和野生型mtDNA的混合体，称之为“异质性(heteroplasmie)”细胞。突变型与野生型mtDNA的比例是决定是否出现生化和临床异常的关键因素。当突变比例不断增大，细胞通过线粒体中氧化磷酸化获得的生物能量下降到一定程度后，就会出现一系列的疾病症状。2）线粒体衰老学说1989年Linnane等认为mtDNA易受到自由基的攻击，引发mtDNA氧化损伤，如氧化损伤的标志物8·OH·dG的产生，导致mtDNA突变，mtDNA突变进一步导致电子传递链缺陷，使活性氧类氧化物生成增加，产生更多的8·OH·dG和mtDNA突变的进一步增加，形成恶性循环导致衰老时生理机能的衰退，而mtDNA突变在其中起核心作用。许多研究已经证实老年性疾病与mtDNA突变存在内在联系。患有帕金森病和阿尔茨海默病患者的组织中，mtDNA的突变率比同龄人显著增高；帕金森病患者的脑皮质中8·OH·dG的含量明显高于正常人。2.ROS对呼吸链的损伤在线粒体内膜上有5个不同的蛋白质复合体涉及氧化磷酸化反应，其中复合体I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组成电子传递链。所有由mtDNA编码的多肽都是氧化磷酸化系统的组成部分，自由基对mtDNA的损伤可以通过mtDNA编码的多肽影响氧化磷酸化过程，此外呼吸链复合体也可能直接受到自由基的攻击。复合体I对羧基自由基和超氧阴离子特别敏感，复合体Ⅳ最易受到过氧化物的攻击，复合体I、Ⅱ也会受其影响。电子传递链复合体易受攻击可能是由于复合体蛋白质易受到氧化损伤。在氧化损伤和氧化磷酸化之间可能存在一个循环机制，由于氧化磷酸化产生自由基，这些自由基可能对mtDNA、蛋白质和膜脂质造成损伤，这些损伤反过来又会影响氧化磷酸化，并产生更多的自由基，这些自由基可能产生更多的氧化损伤，并进一步导致ATP含量的减少。3.自由基对线粒体膜的损伤正常生理情况下，线粒体内膜仅允许不带电荷的小分子通过，外源性的抗氧化物质不易进入线粒体。但是内膜靠近产生自由基的呼吸链，在自由基产生过多时内膜易受氧化损伤，造成线粒体内膜脂质的过氧化反应、膜流动性降低、膜脂质降解等，从而影响跨越线粒体膜的质子梯度，使线粒体合成ATP的功能发生障碍。同时，线粒体的功能障碍又可导致自由基产生增多，过多的氧自由基不能被及时清除，又可引起生物膜结构蛋白质和脂质过氧化，损害线粒体膜的通透性，引起电子传递链活性的进一步下降，进而形成恶性循环，使氧自由基生成进一步增加，最终造成细胞及组织的坏死。线粒体NADH／NADPH的氧化还原状态可维持巯基于还原状态，巯基对线粒体膜通透性具有调节作用。有研究表明，活性氧对细胞的威胁主要与静息状态相关。线粒体在状态Ⅲ向状态Ⅳ转换中，由于ADP耗尽，ATP积累，使得O2消耗的主要途径被切断，导致O2浓度升高。高氧的环境和高还原态的呼吸链正是促使电子漏生成超氧离子的状态。而解偶联作用使线粒体内膜质子漏增加，跨膜电位降低，刺激O2的消耗，缓解超氧离子的产生。4.破坏线粒体的钙稳态细胞浆内游离钙离子的浓度调控着细胞的主要功能，钙离子正常转运对细胞浆钙离子浓度及细胞功能有明显影响，而线粒体是细胞内最重要的钙库，对细胞浆内钙离子浓度平衡的调节至关重要。膜上的Ca2-ATP酶主动地将ca2从胞浆摄入到线粒体基质内，储存起来，维持细胞的钙稳态。ca2-ATP酶是一种膜酶，线粒体膜脂质受到自由基的攻击，发生脂质过氧化可使酶蛋白构象改变。从而影响酶活性。此外，也可能由于Ca2-ATP酶的活性依赖线粒体膜具有适当的流动性，当MDA大量增加时，线粒体膜会变得僵硬，影响Ca2．ATP酶活性，由此导致线粒体摄取钙离子减少，细胞内钙离子增加，严重时引起钙超载。细胞内ca2激活ca2依赖性磷脂酶，使线粒体膜进一步受损，在呼吸链末端生成的ROS进一步增加，持续激活PT孔的开放；细胞内ATP浓度缓慢下降，专一的蛋白酶被激活，引起线粒体内ca2和细胞色素C释放。Ca2激活核酸内切酶，降解细胞核DNA，细胞色素C启动凋亡程序。于是，细胞出现凋亡现象，数量减少。此外，线粒体钙稳态还调节着线粒体内酶的活性，影响能量代谢。已有公认，线粒体钙稳态的破坏是细胞坏死的最后共同通路。5.影响线粒体防御体系参与自由基清除的酶体系“呼吸保护”作用减少活性氧的产生解偶联抑制分子氧的单电子还原通道开放：一种极端的抗氧化机制1）参与自由基清除的酶体系：抗氧化酶类常见的抗氧化酶有超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱苷肽过氧化物酶等。哺乳动物细胞在胞浆产生Cu、Zn—SOD，在线粒体内产生Mn—SOD。SOD可将O2-转化为H2O2。当Cu、Zn—SOD、CAT、GSH—PX活性随年龄增大而降低时，Mn—SOD活性却不断增高直至60岁，而后才开始下降，这表明自由基清除酶在60岁以前可以有效清除自由基，但60岁后，自由基的产生与清除就会失衡，而产生氧化应激，可见，自由基清除酶的功能下降与氧化应激的不断增强，对于人类衰老进程中发生中的mtDNA氧化损伤起着重要的作用。然而有研究发现在低浓度或高浓度SOD状态下，脂质过氧化均明显，而在中度浓度SOD状态下，脂质过氧化降低到最小程度，这可能由于OZ在脂质链式氧化过程中，可同时起启动与终止的作用。所以固然s0D抗氧化作用良好，但体内s0D浓度并非愈高愈好。CAT与GSH—PX同时起着水解H0作用。在哺乳动物细胞中，CAT大多存在于过氧化物酶体中，且分泌较少，而GSP—PX则可广泛存在于线粒体、咆浆、过氧化物酶体，且作用强于CAT，特异性低于CAT，故可降解有机过氧化物，氧化的谷胱甘肽可由NADPH依赖的GSH还原酶还原s0D、CAT、GSH-PX三者相对水平的高低对于它们抗氧化作用的有效发挥很重要。例如，增加的SOD消耗了0，但增多了Ho，过多的Ho若不能被CAT、GSH—PX及时清除，就会有害于机体，然而过多的GSHPX并不必要，它过分消耗了GSH和NADPH，尽管存在着足量的CAT。对DNA而言，唯一有效防御自由基的措施是非酶性的，组蛋白和紧密完整的染色体结构可以有效地保护DNA，然而mtDNA却缺乏组