第四章-蛋白质的物理化学性质

第四章蛋白质的物理化学性质★在国际上首先提出蛋白质的变性理论（1929年提出，1931年发表论文）吴宪每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构。Anfinsen---Anfinsen原理•蛋白质必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系公式和作图法，被称为“邹氏公式”和作图法。邹承鲁一、热力学函数与热力学平衡·内能：组成物体的所有分子的无规则运动的动能与分子间相互作用的势能之和。·焓(enthalpy)：是一个系统的热力学参数。它描述的是体系的一个状态性质，它的改变量仅仅取决于系统的始态和终态，用符号H表示，即H=E+pV其中，E为系统内能，p为其压强，V则为体积。第一节、热力学函数与蛋白质构象•熵（S）:是度量体系混乱度的热力学函数。从微观的角度来看，熵具有统计意义，它是体系微观状态数(或无序程度)的一种量度。熵值小的状态，对应于比较有秩序的状态，熵值大的状态，对应于比较无秩序的状态。内能(E)和焓(H)是体系自身的性质，要认识它们，需凭借体系和环境间热量和功的交换从外界的变化来推断体系E和H的变化值。熵也是如此，体系在一定状态下有一定的值，当体系发生变化时要用可逆变化过程中的热温熵来衡量它的变化值。•热力学把宇宙中我们感兴趣的部分定义为系统，诸如一个生物反应器或一个细胞，而把其他部分叫做它的环境。系统是开放的还是封闭的、隔离的，取决于其是否可与环境交换物质和能量。因为活细胞吸收营养物质、释放代谢产物，并做功和放热。因此它们是开放系统。•系统状态由一组状态函数来定义。这些状态函数包括内能、焓、熵.•这些状态函数可用来表示和解释这两个热力学定律，经典热力学就是建立在这两个定律的基础上的。•①热力学第一定律：能量既不能创生也不能消灭。用数学方式表达为：ΔU=0，其含义是，在任何隔离系统中系统储藏的能量不变。•②热力学第二定律：自发过程向熵值（宇宙的总的混乱程度）增加的方向进行。用数学方式表达为：ΔS＞0，其含义是，在任何隔离系统中，不违背第一定律的过程得以进行的最起码的条件是该系统的熵值增加。•热力学第一定律阐明了任何过程都是能量守恒的，也就是说系统产生的能量必须由它的环境吸收。•第二定律阐明了过程的自发性取决于总的熵变，在这个重新划定的隔离系统中，系统有序程度的增加，必须由它的环境混乱程度的更多的增加来弥补。•而且，过程的自发性不能单独由所研究的系统的熵变来决定，因为即使在系统的熵减少（即ΔS系统＜0的情况下），放热过程（即ΔH系统＜0，也就是热量从系统放出）也可能自发进行。•譬如，变性的蛋白质自发折叠成高度有序的天然构象（系统的熵减少，ΔS系统＜0），就是一例。当然在这种情况下，宇宙的总熵还是增加的，因为环境的熵的增加足以抵消系统的熵的减少。那么用什么量来判断自发过程好呢？•吉布斯自由能(Gibbsfreeenergy，G):亦称吉布斯函数，它是定温定压下系统的状态函数。可以用公式表示为：G=H-TS其中，T为绝对温度；S为体系的熵。这个状态函数是由J.WillardGibbs于1878年提出的。系统自由能的减少等于系统在恒温、恒压可逆过程中所做的最大有用功（不包括位移功）。在不可逆过程中系统所做的功必然小于体系自由能的减少。•由于活细胞中的所有生物化学过程几乎都是在恒温、恒压条件下进行的，在研究微生物的能量代谢时自然会对自由能的变化ΔG发生兴趣。•在恒温恒压条件下，各类化学反应能否自发进行，取决于自由能的变化ΔG的值，但反应的ΔG与变化的途径无关。当ΔG＜0时，自发过程，被称为是放能的（exoergic）过程，它们可以用来做功；当ΔG＝0时，反应已达到平衡，即其正向过程和逆向过程正好处于平衡；当ΔG＞0时，非自发过程，被称为吸能的（endergonic）过程，必须注入自由能才能驱动此类过程。•在细胞中，能直接驱动吸能过程的自由能有两类供体：在细胞内流通的能量货币（以ATP为代表）和能化了的生物膜（以Δp为代表）。•它们一般在代谢过程中形成，在代谢过程中使用，特别是它们作为细胞的组成成分，在细胞的代谢中再生和周转。我们把这两类特殊能量形式叫做代谢能。•注意：①虽然酶对于加速反应非常重要，但它们并不改变反应的ΔG，作为催化剂它们只能加快热力学平衡的达到，却不能使ΔG＞0的反应进行。②反应或过程的吉布斯自由能随温度等变化，其值可以推算。二、热容量•热容量:指系统在某一过程中，温度升高（或降低）1℃所吸收（或放出）的热量。热容量的单位是J/K。•系统的热容量与状态的转变过程有关，与它所包含的物质的质量成正比，不同过程的热容量不同。•通常规定，系统吸收的热量为正值，而释放的热量为负值，故在系统吸收热量引起温度升高时，热容量为正值。•量热实验，特别是近几十年发展起来的使用微分扫描量热仪的实验，使得在蛋白质的折叠或退折叠转变过程中，直接测定热容量的变化成为可能。三、van’tHoff焓•Van’tHoff规则：荷兰科学家范特霍夫(Van’tHoff，1901年诺贝尔奖获得者)提出,温度每升高10K,反应速度一般增加到原来的2-4倍，该规律被称作Van’tHoff规则。Van'tHoff焓主要在两态转变模型的分析中做出了贡献。四、蛋白质构象与热运动•构象:由于单键基本自由旋转以及键角有一定的柔性，一种具有相同结构和构型的分子在空间里可采取多种形态，分子所采取的特定形态称为构象。•构象角:分子的三维结构由绕着双原子共价键的旋转来决定，围绕单键旋转的角度称为构象角,它决定了多肽链的一个结构。•热运动:是指蛋白质溶液中所有分子的不停运动，包括了分子相对于容器的运动和分子内部各部分之间的相对运动。•热运动在溶液中和多肽链的各部分之间传播，主要是通过多肽链各部分之间和多肽链与溶液分子之间的相互作用来实现的。•体系达到热力学平衡时，在空间的一定范围内和在时间的一定间隔内的平均热运动能量不再发生变化，蛋白质处于天然态。五、热力学参数在分子水平上的解释•从分子的相互作用来理解蛋白质天然结构的稳定性。为了使蛋白质折叠起来，就需要通过多肽链各部分间相互作用所引起的内能的减少来抵消构象熵减少带来的自由能增加。键键能/（kj/mol）氢键13～30范德华力4～8疏水作用12～20盐键12～30二硫键210弱的相互作用力对蛋白质稳定性的作用可以用水的性质来理解。熵是水溶液中形成疏水基团间结合的主要热动力学驱动力。稳定蛋白质三维结构的作用力：氢键、范德华力、疏水作用力和盐键（离子键）及共价二硫键。1．静电相互作用•蛋白质的折叠态与退折叠态的空间结构不同，在水溶液中，表现为同一个可电离基团附近环境的有效介电常数的变化，于是它们的pka值（酸度系数）也不同。•静电相互作用对折叠稳定性潜在的重要性。2．范德华相互作用•范德华力（vanderWaalsinteraction），又称为分子间力在物质的聚集态中，分子间存在着一种较弱的吸引力，当两个不带电荷的原子非常靠近时，它们的电子云相互作用，核周围电子位置的随机变化可能产生一个瞬间电偶。该电偶能够诱导邻近的原子产生一个短暂的反向电偶。这两个电偶之间会产生微弱的引力,从而拉近两个原子核。这种微弱的吸引力即为范德华力。•范德华力有三种来源：取向力:取向力是分子的固有偶极同极相互排斥异极相互吸引，定向排列，产生分子间作用力。诱导力:诱导力是分子的固有偶极与诱导偶极间的作用力，它的大小与分子的极性和变形性等有关。色散力:色散力是分子的瞬时偶极间的作用力，它的大小与分子的变形性等因素有关。一般分子量愈大，分子内所含的电子数愈多，分子的变形性愈大，色散力亦愈大。范德华力包括吸引力和斥力。3.氢键（HydrogenBonding）在生物相中最常见的氢键是羟基（-OH）和氨基（-NH）之间，其稳定性递减次序大约是OHNXONHN-NHO，这种键可以发生在分子间、分子内或者二者的结合。氢键对蛋白质天然结构的稳定作用只能来自于水-水氢键+链内氢键，和水-肽链氢键两种情况下的自由能之差。蛋白质中有许多种氢键。分类υOH/cm-1R（O…O）/nm实例弱氢键32000.270H2O(水、水合物)R—OH(醇、酚)中强氢键2800~31000.260~0.270R—COOH(羧酸)强氢键700~27000.240~0.260MH(RCOO)2(酸盐)氢键在蛋白折叠过程中的作用杜克大学的化学家们通过改变蛋白质关键部位的单个原子，发现了相对作用力较弱的氢键在使线形蛋白折叠成能发挥生物活性的最稳定结构中有重要作用4.疏水效应（hydrophobiceffect）•疏水效应:水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。这一现象被称为疏水作用或疏水效应.•蛋白质溶液系统的熵增加（熵变化∆S为正值）是疏水作用的主要动力。疏水作用是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。要使疏水氨基酸R基团排除水而埋在内部，至少需要两层二级结构。两种简单形式，β-α-β环（β-α-βloop）和α-α角（α-αcorner）。5.二硫键•二硫键又称S-S键是共价键。是2个SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的键。在生物化学的领域中，通常系指在肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键。•为了确定蛋白质的一级结构，须在2-巯-乙醇、二硫苏糖类、巯基乙酸等的硫化合物与尿素等变性剂同时存在下将二硫键打开.•二硫键对肽链的正确折叠不是必要的，但它对稳定折叠态结构作出贡献。RNA酶复性实验。6.盐桥或离子键•盐桥或离子键又称盐键，它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。•盐键的形成既是静电相互作用的过程也是熵增的结果。第二节突变、稳定性和折叠•一、体外突变技术1.概念:体外突变技术是用酶学方法和化学方法剪切或合成DNA，将突变导入到克隆化的基因中，再将改变的基因重新克隆到生物体中分析该基因的功能变化的一项技术。2.分类:随机突变定点突变3.应用:研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系。4.具体事例：•改进α-抗胰蛋白酶•提高重组干扰素的专一活性•提高T4溶菌酶的热稳定性•磷酸丙糖异构酶的结构改造提高其稳定性二、突变与热稳定性1.定点突变对蛋白质稳定性的影响氨基酸的插入和删除、寡聚化和脯氨酸取代这三因素可以稳定个别嗜热蛋白。2.导致热稳定性的因素堆积、寡聚化、氨基酸插入和删除、脯氨酸取代、螺旋含量、螺旋倾向、极性表面积、氢键和盐桥。3.突变试验增加蛋白质的亲盐性例如亲盐的苹果酸脱氢酶中的唯一的谷氨酸替换为精氨酸。三、蛋白质折叠1.蛋白质折叠研究的概况※蛋白质折叠:蛋白质的一级结构并没有生物活性，结构决定功能，一维的线型氨基酸序列转化为具有特征三维结构的天然蛋白质才具有生物活性，这种自我组装的过程被称为蛋白质折叠。※追踪蛋白质重折叠的全过程的实验方法：快速核磁共振，快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色）等。※蛋白质折叠技术的研究应当将蛋白质结构研究与折叠过程动力学研究相结合以促进对蛋白质折叠机理的认识。※“新生肽的折叠”问题与中心法则proteinpolypeptide翻译折叠退折叠失活或变性转录逆转录?DNARNA2．蛋白质折叠机制※Anfinsen经典的“热力学假说”认为天然蛋白质多肽链采取的构象是在一定环境条件下热力学上最稳定的结果，采取天然构象的多肽链和它所处的一定环境条件整个系统的总自由能最低。蛋白质多肽链折叠的过程，也就是从众多可能的构象中寻找系统自由能最低的状态的过程。Wolynes提出粗糙能量地形面的观点•即折叠是在一个折叠漏斗中进行的。蛋白质折叠的过程就象多溪流水从具有复杂地形结构的山坡流下一样，而不仅是一溪流水从一单个山谷中流下。•折叠的能量漏斗模型形象地描绘了折叠过程的多路径性图能量漏斗模型种假设※肽链中的局部肽段先形成一些构象单元即α螺旋、β折叠和β转角等二级结构，然后再是二级结构的