植物组织培养第一章绪论

第一章绪论本章主要内容：第一节植物组织培养的含义、类型与特点第二节植物组织培养的基本理论第三节植物组织培养的发展与应用教学目标：掌握组织培养的概念和类型及理论依据；掌握组织培养的特点；了解组织培养发展史及在专业学习中的地位，树立学习本课程的信心；初步掌握组织培养在实践上的应用。重点难点：组织培养的概念、类型及理论依据；组织培养在社会实践中的应用。§1-1植物组织培养的含义、类型与特点一、植物组织培养(tissueculture)的含义在无菌条件下，将离体植物的器官、组织、细胞或原生质体在人工配制的培养基上，并给予适当的培养条件使其长成完整植株或生产次生代谢物质的过程和技术。也称离体培养（Invitroculture）。二、此定义内涵：1、无菌条件：外植体、培养基、培养容器、接种工具、操作环境、培养环境等。2、外植体：从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。包括营养器官、生殖器官、组织、细胞等。关键条件，组培成功的保障。花（flower）叶（leaf）茎（stem）根（root）果实（fruit）种子（seed）3、培养基：是植物组织培养的重要基质，它提供植物生长所需的营养物质。人工配制，成分确定。4、组培的理论基础：植物细胞的全能性。5、激素：调控培养物的状态和发育方向，实现不同的实验目的。6、封闭培养：通过封口材料实现气体交换。7、培养条件：人为控制。三、植物组织培养的四要素（1）无菌（2）培养材料：①器官：根、茎、叶、花、果实②组织：花药组织、胚乳、皮层等③细胞：体细胞（2n）、生殖细胞（n）④原生质体（3）培养基（4）培养条件：温度、光照、湿度等四、与组培有关的术语1、植物细胞全能性：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。原理：植物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，植物体的每一个活细胞都应该具有全能性。2、外植体：从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。供离体培养用的植物器官统称外植体。3、愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。4、分化：具有分裂能力的分生细胞停止分裂，形成具有各种特殊构造和机能的细胞组织和器官的发育过程。5、脱分化（去分化）:已经分化的细胞在一定因素的作用下，改变原来的发展方向，重新恢复分裂能力的过程。6、再分化：愈伤组织在合适的条件下，重新分化形成具有各种特殊功能或结构的器官和组织的过程。分化脱分化再分化7、胚状体：非合子细胞形成的胚状结构，如兰花的原球茎。8、胚胎发生：培养物通过与正常的受精卵发育相似方式形成胚状体的过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期）。五、植物组织培养的类型（一）原生质体培养细胞培养组织培养器官培养胚胎培养植株培养培养对象1、植株培养：对完整植株材料的无菌培养，如幼苗及较大植株的培养。植株培养2、胚胎培养：从果实或子房中分离出未成熟或成熟的胚的无菌培养。胚胎培养胚胎培养的人工种子白菜甘蓝白菜甘蓝白蓝3、器官培养：对植物根、茎、叶、花、果实的无菌培养。（常用）实例：非洲紫罗兰的组织培养4、组织培养：对植物体所有组织如分生组织、胚乳组织、薄壁组织、花药组织、愈伤组织的培养。愈伤组织培养5、细胞培养：对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞、花粉单细胞或很小的细胞团的无菌培养，以获得无性繁殖系。细胞培养6、原生质体培养：对用酶、物理等方法除去植物细胞壁的、裸露的、有活性的原生质体团的无菌培养。菊花原生质体培养植物组织培养的类型（二）培养过程初代培养继代培养初代培养：将外植体进行的第一次培养。继代培养：外植体或培养物培养了一段时间后，为了防止培养的细胞老化，或培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多积累而产生毒害物质的影响，要及时将其转接到新鲜培养基的过程。转接培养，转接一次称为一代，依次类推。继代培养的目的：快繁初代培养的目的：获得无菌材料继代培养初代培养继代培养初代培养和继代培养不断地继代培养植物组织培养的类型（三）培养基的物理状态固体培养液体培养双相培养固体培养：加入琼脂等凝固剂使培养基成固体状态的培养。优点：是最常用的方法。该方法简单，易行，能较好地固定培养物。缺点：但养分分布不均，营养成分不能得到充分利用，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。产生的有害物质不能及时清除。固体培养固体培养液体培养：在培养基中不加入任何的凝固剂使培养基呈流体状态的培养，由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的方法以确保氧气的供给。往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为50-200r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。缺点：不能较好地固定培养物，优点：营养成分得到充分利用，产生的有害物质能及时清除液体培养：在培养基中不加入任何的凝固剂使培养基呈流体状态的培养，由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的方法以确保氧气的供给。往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为50-200r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。缺点：不能较好地固定培养物，优点：营养成分得到充分利用，产生的有害物质能及时清除液体培养摇床双相培养：固体、液体混合培养，协调了固体、液体培养的优缺点六、植物组织培养的技术特点（优越性）1、试验材料来源单一，无性系遗传特性一致；2、成本低，效率高；3、环境条件可控，误差小；4、生长快，周期短，可重复性强；5、可连续运行、周年试验或生产，利于自动化控制。§1-2植物组织培养的基本理论一、植物细胞全能性1、定义:植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。潜在全能性的原因：基因表达的选择性。科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。植物组织培养再分化脱分化愈伤组织外植体试管苗植株3、实现全能性的条件3.1离体条件3.2给予适当的条件，如激素等。二、植物的再生性（一）再生性（细胞全能性的实现的过程）外植体分生细胞愈伤组织根、芽（完整植株)脱分化多次分裂再分化脱分化是全能性表达的前提，再分化是全能性最终体现。细胞全能性的实现可望不可及植物全能性的表达离体的植物器官、组织、细胞游离单细胞或原生质体胚状体根、芽愈伤组织人工种子再生植株脱分化愈伤组织形成诱导期分裂期分化期（二）愈伤组织的形成和形态发生1、形成过程①启动期（诱导期）：细胞准备进行分裂的时期。是愈伤组织形成的起点。长短因不同植物而不同，如与植物种类、外植体的生理状态、外部条件有关。②分裂期：外植体细胞经过诱导后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。细胞数量大量增加，分裂速度大于生长速度；此时期特点：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅，生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色或呈透明状。细胞体积较小，数量多，恢复到分生组织的状态，进行脱分化，要及时转瓶，否则发生分化，若转入新鲜培养基，可无限地进行分裂，保持不分化状态。分裂期③分化期：停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成不同形态和功能的细胞过程。此时期特点：细胞分裂部位由愈伤组织表面转向内部，出现瘤状结构和维管组织和各种类型的细胞，表现出一定的形态特征，颜色鲜艳有光泽。为暂不再进一步分化的生长中心。分化期2、愈伤组织的生长在愈伤组织生长缓慢或停止生长时，要及时进行继代，选择颜色鲜艳，生长旺盛者切割，大小要适宜，太小难以恢复分裂和生长，太大则分裂速度慢。在分裂期进行3、愈伤组织的分化在分化培养基上，会出现2种途径形成完整植株，取决于植物种类、外植体类型、生理状态、生长条件。①、器官发生a、先芽后根：普遍的发生方式。如小麦、芦荟、苹果b、先根后芽：后期芽的分化难度比较大。多见于双子叶植物，单子也少见。如枸杞、苜蓿。c、同时出现根和芽：特殊的发生方式，少见，如胡萝卜、石刁柏（芦笋）。d、仅有根或芽再生，形成无芽根或无根苗，少见，如茶树。形成过程略。常见愈伤组织芽分化再生苗小麦愈伤组织器官发生途径百合鳞叶培养烟草②、体细胞胚胎发生对此概念的理解a、体细胞胚是组织培养中形成的，只限于组培范围，不同于无融合生殖产生的胚；b、起源于非合子细胞，不同于来自受精卵的合子胚；c、体细胞胚形成过程中经历的胚胎发育过程，不同于组织培养器官分化过程。最初是在1958年首次在胡萝卜根离体培养通过体细胞胚而形成再生植株取得成功的，目前有200多种植物可观察到胚状体发生。来源有二：①植物体多种器官、组织、游离的体细胞发育形成二倍体；②小孢子等单倍体产生的花粉胚，发育形成单倍体，经染色体加倍后形成二倍体。胚状体发生途径1、直接发生从器官、组织、细胞等直接分化出胚，不经过愈伤组织阶段，是植物的特性，如山茶子叶，2、间接发生外植体先愈伤化，然后由愈伤组织分化体细胞胚，如槐树子叶，多数植物以间接发生为主。发生过程略。石斛三、根芽激素理论激素是影响器官建成的主要因素。受内源激素和外源激素的共同影响。一般地，生长素/分裂素=高，促进生根；生长素/分裂素=低，促进茎芽分化；生长素/分裂素=适中，无结构的生长方式。外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(2,4-D)高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)四、组培苗遗传稳定性的问题是组培中常遇到的一个重要问题（一）影响因素1、基因型2、继代次数和继代时间3、发生方式4、外源激素（二）减少变异，提高遗传稳定性的措施1、采用生长点、腋芽生枝、胚状体繁殖方式；2、缩短继代时间和限制继代次数；3、取幼龄的外植体为材料；4、采用适当的激素种类和较低的浓度；5、减少使用易引起诱变的物质；6、定期检查，发现变异者应予与淘汰。§1-3植物组织培养的发展和应用一、发展简史(略)1、探索阶段：19世纪中期至20世纪30年代（1838-1930年）★1838年初步提出全能性概念，★1853年离体茎段、根段获得愈伤组织，但未获得完整植株，★1901年正式提出全能性概念，White对此概念做解释，★1902年Haberdandt首先进行植物组织培养，未或成功；★1922年Knudson兰花无菌播种；2、奠基阶段：20世纪30年代至50年代末（1930-1965年）★1934年White蕃茄根尖培养，可以继代培养，并发现VB；★1941年植物添加物的使用；★1948年SkoogandTsui烟草培养产生不定根或不定芽，取取决于auxin及adenin的比例，并发现6-BA;★1954年Muir等人成功的由单细胞培养产生再生植株;★1958年胡萝卜获得胚状体；★1962年MurashigeandSkoogMS培养基配方；★1965年细胞培养获得完整植株，证实了全能性。3、蓬勃发展阶段：20世纪60年代至今（1965年-至今）★1966年、67年烟草、胡萝卜小孢子培养获得单倍体植株；★1971Takebe等人原生质体培养产生再生植株，证实了细胞分化全能性。二、植物组织培养的应用1、育种1.1单倍体育种，缩短育种年限:利用花药培养等方法诱导产生单倍体，从而选育出新的品种如烟草、水稻、小麦、苹果、柑橘、葡萄、草莓、甜椒、甘蓝等。1.2培育远缘杂种：甜橙与枳的杂种(枫橙)；马铃茄、白蓝。1.3筛选培育突变体：射线或化学诱变，培育出抗花叶病的甘蔗无性系，抗除草剂的白三叶草细胞株系，耐盐的杨树株系。。1.4转基因：马铃薯、番茄、水稻、棉花、大豆等。1.5种质资源的保存：随着地球不断开发、生态环境破坏，种植资源日趋枯竭，大量有用基因损失