复旦医学遗传学实验课件03凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测

凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测实验（1）原理免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。原理Bax——凋亡相关基因Bcl-2家族成员细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化）作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放Cytc，细胞凋亡原理本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。此复合物与SABC作用，使得检测物被放大，最后在显色剂DAB的作用下，Bax构象蛋白显色（褐色）。器材与试剂仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜材料：培养细胞试剂：甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAB、0.3％H2O2-PBS、试剂说明PBS：磷酸盐缓冲液（0.01MpH7.4）封闭液：山羊血清(或BSA)，用时PBS稀释一抗：小鼠IgG，用时PBS稀释二抗：生物素标记的羊抗小鼠IgG0.3％H2O2-PBS（甲醇）消除内源性过氧化物酶活性作用SABC(avidin-biotin-peroxidasecomplex链酶亲和素——生物素——过氧化物酶复合物)：抗生物素，起到放大作用DAB(diaminobenzidine)显色液：3,3´-二氨基联苯胺实验步骤培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复）PBS洗3次(轻轻地摇动洗涤)甲醇固定10minPBS洗3次(轻轻地洗涤)加入封闭液（1:10）25µl，37℃，30min以上加一抗（1:300）25µl，37℃，1h以上(或4℃过夜)PBS洗3次(轻轻地摇动洗涤)加二抗（1mlPBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG10µl）25µl，37℃，1h以上PBS洗3次(轻轻地摇动洗涤)实验步骤加0.3％H2O2-PBS/甲醇，37℃，30minPBS洗3次(轻轻地摇动洗涤)SABC工作液（1mlPBS加入SABC10µl，混匀）20-30µl，37℃，30分钟PBS洗3次(轻轻地摇动洗涤)DAB显色：DAB显色工作液配制（现配）：1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各50ul，混匀后加至细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。观察结果实验结果缺糖前Hela细胞缺糖24hHela细胞缺糖48hHela细胞缺糖前PC12细胞缺糖24hPC12细胞缺糖48hPC12细胞注意事项一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。染色背景过高，在DAB显色之前，用含0.01-0.02％TWEEN20的PBS洗涤标本4次，再PBS洗2次，然后DAB显色。DAB有毒性（小心）SABC试剂盒保存在4℃为佳(2年)，而-20℃短期内生物活性则被破坏。购试剂盒时注意厂家批号，其差异很大，会影响稳定性。