2第二章_基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础Enzymes一、限制性核酸内切酶第一节限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease）2.性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保护作用3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Linn和Arber发现大肠杆菌B大肠杆菌K114×10—410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA核酸限制性核酸内切酶的发现：切酶。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。限制—修饰的酶学系统酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰基因组DNA不被切割Ⅰ型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型Ⅱ型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶IV型限制性内切酶限制性核酸内切酶的类型及其主要特性特性1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5‘端至少1000bp不是（随机）无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+位于识别位点上是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是用处不大1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示2.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗药性R质粒3.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。如HindⅡ：d菌株中发现的第二个酶4.所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如R.HindⅢ表示限制性内切酶M.HindⅢ表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）4-6bp。与DNA的来源无关，即没有种的特异性。四.Ⅱ类限制性内切酶的基本特性分离的第一个酶是HindⅡ稀有切割限制酶（rarecutter）可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。如NotI（GCGGCCGC）某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。如HindⅡ可识别4种核苷酸序列：Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端（2）切割位点切开双链DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’[1]粘性末端（stickyends，cohensiveends）ⅰ）5’端凸出（如EcoRI切点）CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTCⅱ）3’端凸出（如PstI切点）i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易得多。[2]粘性末端的意义①连接便利ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。[3]平齐末端（bluntend）在识别序列的对称轴上同时切割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoRV不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。识别位点和切点完全相同如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂酶（Isoschizomer)①完全同裂酶：XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。[6]同尾酶(Isocaudamers）限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。影响限制酶的酶活性的因素星号（*）活性EcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！7诱发星号（*）活性的原因ⅰ）高甘油含量ⅱ）内切酶用量过大ⅲ）低离子强度ⅳ）高pHⅴ）含有机溶剂，如乙醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二节DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口DNA连接酶:一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶1967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。（1）大肠杆菌连接酶1.两种共价连接DNA限制片段的DNA连接酶连接粘性末端，准确性高,NAD+齐平末端，效率低二、DNAligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端DNA-DNARNA-RNADNA-RNAATP（1）必须是双链DNA（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）（3）需要能量ATP或NAD+2.DNA连接酶催化的连接反应特点（4）只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。OHP××是相邻的－因此只能封闭nick.不能封闭gapgapNONickOK三、DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr1.反应温度理论37℃黏性末端：12～16℃平头末端：10～20℃2.ATP浓度一般，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L.ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末端的连接ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。四、影响连接反应的因素3连接酶的浓度：平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片段之间的连接，0.1个单位。时间：16℃4小时4℃过夜增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。4.DNA末端的浓度3:1插入片段与载体的浓度比例两种构型：线状分子和环状分子与DNA浓度及DNA分子长度相关注意事项：10xLigationBuffer含有ATP，使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。T4DNALigase对热敏感，容易失活。使用时请放置冰上，用后立即置冰箱中冷冻保存。第三节DNA聚合酶和反转录酶DNA聚合酶（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’－OH末端，催化核苷酸的聚合作用.一、基因工程中常用的DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶7.TaqDNA聚合酶1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’－OH端2.主要区别T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。有的DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.常用DNA聚合酶的特性比较三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ主要用来制备带放射性标记的DNA探针（32P标记）。（1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质①一条单链多肽②5’3’外切酶活性位于N端③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分,就成为Klenowfragment。2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性质DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草杆菌蛋白酶①3’端补平5’5’klenow②DNA3’末端标记补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h③cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物（1）T4DNA聚合酶的性质3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化，由噬菌体基因43编码。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性③特点A当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。B如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。C在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’（2）T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法或置换合成法）用3’5’外切酶活性作用于