化学发光第一部分.

化学发光和生物发光I一、引言•公元前亚里士多德真菌类和死鱼的发光•1668年，罗伯特.波义耳BL需要氧参与•19世纪80年代末，Dubois命名荧光虫素酶和荧光虫素•1877年，Radziszewski发现洛汾碱的CL•1928年，Albrecht发现luminol的CL•1935年，光泽精的CL•1950年，商品化仪器出现•化学发光是化学反应的反应物或生成物（或荧光物质）吸收了反应释放的化学能后所产生的光辐射。根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法叫化学发光分析法。SeaPansyRenillaluciferaseCORALS1cm1cm1cm1mm二、常见的溶液化学发光和生物发光体系•鲁米诺化学发光反应体系•过氧化草酸盐反应体系•光泽精化学发光反应体系•吖啶酯类化学发光反应体系•1,2-二氧杂环丁烷类化学发光体系•高锰酸钾化学发光反应体系•Ce(IV)化学发光反应体系•钌(II)-联吡啶配合物化学发光反应体系•铁氰化钾直接氧化反应体系•电化学发光反应体系•荧火虫素（luciferine)-荧火虫素酶（luciferase-磷酸三腺苷（ATP）体系•NADPH：FMN氧化还原酶和细菌荧光素酶催化的发光反应•其他化学发光反应体系1.鲁米诺化学发光反应体系鲁米诺化学发光反应机理NHNHOONH2ONNOOOHNH2a-hydroxyperoxyde-N2NH2OOOHO*NH2OOOHO+lightLuminolOONHNHXNHNHOOXONHNHON4X=NH2(isoluminol)5X=(C2H5)2N6X=7X=(CH3)2N8X=(C2H5)2N9X=N10•鲁米诺衍生物环状酰肼结构是发光的关键NHOONNH2CH3322NHNOONHCH2NHCONHNH111213NNNOOOONHHHRR12152CONHNHHOSNNS1422OONHNHNHC52HN()CH416OOHOHOOHNHAcONNHNH217OONHNHXNHNHOOXONHNHON4X=NH2(isoluminol)5X=(C2H5)2N6X=7X=(CH3)2N8X=(C2H5)2N9X=N10鲁米诺反应体系的应用•金属离子或酶的催化作用——测定金属离子或酶•H2O2或其他氧化剂——测定过氧化氢或氧化剂•某些分子的增强、抑制作用——测定此类分子•偶合反应——间接测定无机或有机化合物•通过标记化合物——测定此类物质或免疫分析2.过氧化草酸酯类反应体系OClClClCCOOOClClCl典型过氧化草酸酯分子结构式双(2,4,6-三氯苯基)草酸盐•过氧化草酸酯体系发光机理ArOCCOArOOH2O2+OOCCOO+2ArOHOOCCOO+FOOCCOOFOOCCOOFF*+2CO2F*F+light•双(2,4-二硝基苯基)草酸酯-过氧化氢-红荧烯，发光总量子产率23%。为效率最高的化学发光反应。•溶解度小，不稳定，浓度猝灭效应强TCPO-CL在药物分析中的应用待测物CL体系LODorLR安非他明TCPOH2O2fmol苄达明TDPOH2O2双密达莫TDPOH2O2DOP10amol叔胺类TCPOH2O2500pg仲胺类DNPOH2O2100fg伯胺类TCPOH2O25fmol咔唑类化合物TCPOH2O20.5－0.7ng美托洛尔TDPOH2O20.8ng/mL硫醇类TCPOH2O27－113fmol雌二醇TCPOH2O250pg前列腺素E2TCPOH2O250fmol透明质酸TDPOH2O2无机磷TCPOH2O2perylene50mol/L甲状腺素TCPOH2O210pmol/L乌本苷DNPOH2O22－20pmol/L胆固醇TCPOH2O2400ng苯异丙胺TCPOH2O20.001pmol3.光泽精化学发光反应体系•光泽精化学发光反应NNCHCH33NO3--3NO光泽精的分子结构式NCH33HCN3HCN3HCN3HCN3HCN3HCNCOORCOCl+COOOH+HOCOOHOOOOHOOROOO+HO22OHHO2OH2222324*h4.吖啶酯类化学发光反应体系OOOPONa32OCH3O-OOOCH3OO-OCH3OO-OCH3OAP-HPO42-+[]*+光AMPPDAMP-DOOOPONa32OCH3O-OOOCH3OO-OCH3OO-OCH3OAP-HPO42-+[]*+光AMPPDAMP-D5、1,2-二氧杂环丁烷类化学发光体系6、酸性高锰酸钾化学发光体系•高锰酸钾-吗啡•高锰酸钾-连二亚硫酸钠体系•KMnO4(H+)-甲氧苄啶-硫代硫酸钠化学发光反应体系•KMnO4(H+)-EC-RNA化学发光体系•高锰酸钾-草酸高锰酸钾-亚硫酸盐体系发光机理最佳pH=2.5HSO3¯+MnO4¯→HSO3+MnO42¯2HSO3→S2O62¯+2H+S2O62¯→SO42¯+SO2*HSO3¯为SO2水解生成，pH=2.5时比例最大高锰酸钾－TCsCL体系测定盐酸四环素、盐酸土霉素待测物CL体系LOD吗啡MnO40.7pg吗啡MnO450ng氯普唑仑MnO4163ng丁丙诺啡MnO40.5pmol儿茶酚胺MnO4pmol磺胺甲基异噁唑MnO4？苯佐卡因MnO430ng/mL布他卡因20ng/mLbutoform30ng/mL普鲁卡因40ng/mL丁卡因3ng/mL可待因8pmol海洛因？高锰酸钾CL体系的应用过氧化氢－药物氧化还原化学发光体系测定核黄素、VB1、四环素、土霉素、金霉素等7.过氧化氢直接氧化化学发光体系8.Ce(IV)化学发光反应体系•Ce(IV)－SO32-体系•Ce(IV)－Ru(bpy)32+CL体系•Ce(IV)直接氧化药物产生化学发光1、Ce(IV)－SO32－体系lightanalytesanalytesCe(III)analytesanalytesCe(III)SOCe(III)SOCe(IV)***24*23喹诺酮类化合物（氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星等）的FIA－CL测定2、Ce(IV)－Ru(bpy)32+CL体系利用此体系测定测定丙酮酸、Vc、巴比妥酸、酒石酸等Ru(bpy)32++Ce(IV)→Ru(bpy)33++Ce(III)Org+Ce(IV)→Org-Ce(IV)快反应Org-Ce(IV)→[·Org]*+Ce(III)慢反应Ru(bpy)33++[·Org]*→[Ru(bpy)32+]*+P[Ru(bpy)32+]*→Ru(bpy)32++hν3、Ce(IV)直接氧化药物产生化学发光利用此体系测定一系列药物，如奎宁、奎尼丁、辛可宁、萘普生、卡托普利、非那西汀、青霉胺、安乃近、VK3等。9.钌(II)-联吡啶配合物化学发光反应体系lightRu(bpy)Ru(bpy)Ru(bpy)Ru(bpy)Ru(bpy)Ru(bpy)23*23*23333323Ru(bpy)33+－药物氧化还原CL体系的应用待测物DLorLR肼苯哒嗪红无霉素－内酰胺抗生素可待因8.3×10-7M鸦片碱1.0×10-7M6－巯嘌呤3×10-10g/mL雷尼替丁氢氟噻嗪环噻嗪10.铁氰化钾直接氧化反应体系铁氰化钾直接氧化发光体系尿酸伯胺、仲胺马来酸麦角新碱芦丁Vc酮酸四环素3,5-四氢醛甾酮N-溴丁二酰亚胺（NBS）可以在碱性介质中氧化脲产生强的化学发光。H2NCONH2+H2O2NH3+CO23NBS+2NH3+3OH-3NHS+N2*+3Br-+3H2ON2*+fN2+f*f*f+h11.NBS体系NBS体系还用于测定异烟肼链霉素、氨基吡脒等12.电化学发光反应体系•电化学发光分析是对电极施加一定的电压进行电化学反应，反应的产物之间或与体系中某种组份进行反应产生化学发光，用光电倍增管等光学仪器测量发光光谱和强度，从而对物质进行痕量分析的一种方法。12.1电致化学发光反应体系•ECL物质包括三联吡啶（或联吡嗪或林菲罗啉）的钌、锇和铼类络合物、鲁米诺、吖啶酯等。研究最多的还是钌(II)-联吡啶的ECL。e-电极e-Ru(bpy)32+Ru(bpy)33+Ru(bpy)33+Ru(bpy)32+还原剂氧化产物Ru(bpy)3+Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+*发光（620nm）Ru(bpy)32+和还原性分析物的ECL反应机理12.2鲁米诺电化学发光体系•在电极上所产生氧化性物质来氧化鲁米诺产生化学发光。在电极上施加一定的电压，从而使溶液中的溶解氧还原成H2O2，H2O2进一步反应产生一些具有强氧化性的氧自由基，这些活性氧与鲁米诺反应产生化学发光•鲁米诺直接接受电极通过的能量生成激发态或自由基离子，从而产生化学发光。•鲁米诺电化学发光体系在分析化学中应用主要分以下四类：（1）测定H2O2，或通过偶合反应测定生物活性物质，如葡萄糖、乳酸等。（2）基于金属离子对鲁米诺电化学发光反应的催化作用，测定金属离子,，如Co2+、Cu2+、Ni2+。（3）基于一些有机物对鲁米诺电化学发光体系的增敏或抑制作用测定这些有机物，如异烟肼、肾上腺素、没食子酸。（4）利用不同的电极材料，测定鲁米诺或鲁米诺所标记的物质。12.3电位溶出化学发光反应体系SampleVabPMTFECWastePump1RILight-tightPump2ElectrolyteCarrierstreamWCOut特点：•1.高灵敏度和高选择性•2.结合了两种方法的优点，克服各自的缺点•3.从原理上说，所有能用电化学方法富集且能用CL检测的物质都可用此法测定。•电化学富集数据完善，CL检测体系很多。此方法有很好应用前景。12.4电生试剂化学发光反应体系电生试剂化学发光分析Co(Ⅲ)+quinine(Red)→Co(Ⅱ)+quinine(OX)*Quinine(OX)*→quinine(OX)+hυ(540mm)Mn3++HSO3-→HSO3+Mn2+2HSO3→S2O62-+2H+S2O62-→SO42-+SO2*SO2*+quinine→quinine*+SO2quinine*→quinine+hυ(450nm)Mn3++pyruvate+O2→Mn2++1O2+product1O2+1O2→2O2+hυ(640nm)abPumpSampleVEJH2CDWasteFPCFig.1MInletOutletWCMFig.213、荧光素（luciferine)-荧光素酶（luciferase-磷酸三腺苷（ATP）体系检测食品中总菌数腰鞭毛虫（Dinoflagellate）荧光素酶含有三个结构域，每个都具有发光活性，底物为腰鞭毛虫荧光素，同时需要O2参与；该荧光素在中性pH条件下与一种特定的荧光素结合蛋白（LBP）结合并被持续氧化，当pH下降时荧光素与结合蛋白解离并与上述荧光素酶结合，因此改变pH可调控其发光强度变化。NC水母素（Aequorin）及奥贝林（Obelin）含腔肠素（Coelenterazine）过氧化物生色团，因此只需要Ca2+激活14、NADPH：FMN氧化还原酶和细菌荧光素酶催化的发光反应)P(NADFMNHHFMNH)P(NAD2FMN:H)P(NAD氧化还原酶hvOHRCOOHFMNRCHOOFMNH222细菌荧光素酶hvOHRCOOHFMNRCHOOFMNH222细菌荧光素酶细菌荧光素酶（luciferase，LUX）由两个对称的杂合二聚体构成，底物为FMNH2和醛不同生物发光荧光素的结构及其中间产物和最终发光分子不同生物发光荧光素的结构及其中间产物和最终发光分子水母荧光素细菌荧光素（FMNH2）腰鞭毛虫荧光素萤火虫荧光素发光分子发光分子发光分子发光分子长链醛15、基于纳米材料的CL•纳米TiO2•乙醇，丙酮Anal.Chem.2002,74,120-1