病毒的分离鉴定

病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。1.病毒的分离1.1标本的处理1.1.1标本的收集a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。1.1.2除菌处理a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4小时。c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。1.2病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。1.2.1鸡胚接种a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致。b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。d)接种：图2.鸡胚羊膜腔接种：用12～14天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感图1.鸡胚卵黄囊接种：用5～8天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄e)剖检及收获收获前鸡胚应置4℃冰箱过夜，使鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。f)优缺点优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大、不需特殊设备。缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。1.2.2细胞培养细胞培养(cellculture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。根据细胞的图3.尿囊腔接种用9～12天鸡胚，将标本接种于尿囊腔,孵育后取尿囊液检查,常用于培养图4.绒毛尿囊膜接种：用10～l2天鸡胚，以无菌手续在蛋壳上开—小窗，然后将材料滴在绒毛尿类型和培养细胞代数的不同，可将其分为两种：原代细胞培养；传代细胞培养。组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病变后，就可取培养液或培养液与细胞培养物混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻融、超声波等方法使其释放出来。优点：a)每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等；b)无个体差异，准确性和重复性好；c)可严格执行无菌操作；d)细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；e)应用空斑技术可进行病毒的克隆化。2.病毒的鉴定2.1形态学鉴定细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE）：病毒在细胞内增殖后，可引起细胞的不同变化。常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或脱落。CPE出现的时间是鉴定病毒的标志之一。某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，病毒学上称为包涵体。2.2血吸附和血凝作用多见于以出芽方式释放的病毒。血吸附指感染细胞具有吸附红细胞的能力；血凝作用指感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用。2.2.1血吸附实验具有血凝能力的病毒能使感染的细胞吸附红细胞，这种现象被称作吸附作用。大多数粘液病毒能引起吸附。具体检验步骤如下：a)用PBS配制10%的豚鼠红细胞悬液，4℃保存，用前按需要量稀释成0.5%的浓度（10%悬液1ml加19mlPBS混匀）。b)吸去对照和试验管培养细胞的上清液，试验管的上清液留待电镜观察。c)每管加入0.2ml红细胞悬液，4℃孵育30min。用4℃的PBS清洗培养细胞3次。d)显微镜下读取结果并记录，根据吸附红细胞的量可分为0（阴性）~4（完全吸附）级。e)37℃孵育60min，有神经氨酸酶的病毒将会从红细胞上游离下来。2.2.2血凝实验a)在血凝板第一排的1~12孔加入50μl生理盐水。b)在第1孔中加入50μl病毒，混匀后吸50μl到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，混匀后弃50μl；最后两孔（11、12）为红细胞对照。c)将1%的红细胞轻轻摇动混匀，在1~12孔中每孔加入50μl。d)手工震荡，37℃静置30min（室温40min）后观察结果。2.3电子显微镜检查病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。2.3.1正染法：超薄切片法取材→固定（戊二醛/四氧化锇）→清洗与脱水→浸透、包埋与聚合→切片→染色（铀染/铅染）a)优点：可观察病毒形态和形态发生过程。b)缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存。2.3.2负染技术负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。具体步骤（漂浮法）为：现将需负染的样品滴几滴在干净的载玻片上，再将有支持膜的载网漂浮在样品液滴上以沾取样品，用滤纸吸干样品余液使样品在载网上仅有一薄层液膜，在样品未干时即加一滴复染液的铜网上，用滤纸吸干多余的染液即可。a)优点：快速简易（10-20min）；分辨率高；图象清晰地病毒结构。b)缺点：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有样品应处于悬浮状态。2.4血清学试验可采用ELISA、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗原。2.4.1中和反应利用病毒与特异性中和抗体结合的特性鉴定病毒的种类，观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应。2.4.2酶联免疫吸附试验（ELISA）将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。2.5分子生物学技术提取病毒核酸，PCR扩增后，通过核酸电泳或测序鉴定病毒。