NCCLS的评价方案

第五节CLSI标准与指南的简介临床实验室标准化协会（CLSI，以前称NCCLS）是一个国际性的、学科间的、非盈利性的、制定标准的教育组织，它促使人们对标准和指南达成共识并促进其在医疗保健系统内的应用。在为临床试验与相关的医疗问题制定标准与指南时，CLSI实施了它所特有的达成一致的过程，因而得到全世界的认可。除了促进制订并使用统一的标准和指南之外，CLSI还提供了一个公开的、无偏见的论坛以讨论那些影响临床试验和医疗保健质量的关键问题。建立一个新的分析方法，或引进新的方法，试剂和仪器都应对它们的技术性能如精密度，方法比较，线性范围，以及干扰等作出评价。CLSI制订了一套评价方案(evaluationprotocols，EP)，能客观而正确地对上述技术性能作出评价。以下对各评价方案作逐一简述。一、EP-5定量实验精密度评估方法EP-5文件于1992年推出试用版，在1999年被认可。该文件最初由设备生产商对他们的方法学精密度进行评估。精密度通常作为评价规范条件下某一独立实验结果是否一致的指标。在ISO3534和ISO5725文件中,关于精密度的定义有详细论述。目前,在最小变异条件下实施(相同的操作者、方法、设备、实验室)的重复性实验被用来评价精密度。EP-5文件规定,精密度是评价分析方法、试剂和仪器给出结果的可重复程度，且反映精密度好坏的指标是变异系数(CV)。CV越小精密度越好，反之则差，故有人称其不精密度。用本方案评价可以计算出批内、批间、日间和总CV，其中总CV最重要，它代表整个分析体系的可重复程度。EP-5文件作为定量实验精密度评估指南,包括了对于方法学和设备进行的详细论述。该文件对现行方法进行重要修改是否可行也进行了论述。当对体外诊断设备或者方法进行修改时,必须保证该设备的某些重要性能参数没有改变。典型的改变包括试剂、样本来源、校正物或者质控物的改变。二、EP-6定量检测方法线性的评价常规方法应具有较宽的分析范围，一般应覆盖临床可能出现的高值。线性范围(Linearitvrange)是分析方法的一个重要技术指标，它能判断对某一分析方法(试剂或仪器)测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值之间的比例关系的范围。而检测线性范围是通过可接受的分析测定范围的高和低值拟合成一条直线。目测法是实验室工作人员最早考虑使用的也是最基本的线性评价方法。其步骤一般是先检测一系列稀释样品，然后作图；以X轴表示标准溶液每个浓度的理论预计值、y轴表示实际测定值的均值，连接各点并观察。因为目测法过于主观，最好能有客观地采用统计学方法的线性评价方式。为了解决以上难题，美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)1982年组成了线性评价工作委员会，成员分别包括厂商代表、专业人员和政府代表。经过不懈努力，NCCLS在1986年颁布了建议性文件——EP6。根据此文件，线性评价应：(1)至少需要足量的五等分浓度，覆盖检测范围；(2)每个浓度至少重复2次检测以减小随机误差；(3)定标并确定质控在控后才能检测，检测时样品应随机排列；(4)最小二乘法回归分析拟合最适直线。EP-6文件兼顾线性评价的主观目测和客观统计，受到实验室工作人员欢迎并被广泛采纳使用三、EP-7临床化学的干扰试验干扰是指在测定某分析物的浓度或活性时，受另一非分析物影响而导致测定结果增高(正干扰)或降低(负干扰)。干扰物质可分为内源性(标本中存在的)和外源性(外界污染的)两类。内源性的干扰物有：(1)血清中固有的代谢产物，如肌酐酶法测定时血清中的肌酸等。(2)病理情况下生成的：如胆红素，脂类，蛋白质，血红蛋白等。(3)治疗药物，肠道营养等。外源性干扰有：(1)标本收集中的添加物如抗凝剂、防腐剂、稳定剂、容器和塞子的污染等。(2)试剂中的杂质和杂酶等。干扰对于临床测试非常重要，测定结果与“真值”间的偏差，可由测定方法的系统误差，不精密度和干扰共同引起。干扰可能是造成误差的一个原因，如果干扰物是恒定的将引起恒定误差，如干扰物随病理生理因素影响，将引起随机误差。因此，实验室应了解各测定方法的干扰情况，临床上主要是指溶血，黄疸和脂血和某些特殊项目的特殊干扰。干扰试验方法分为两种：(1)“配对差异”试验。即将不同浓度的干扰物加入到实验标本中，然后分别测定加与不加干扰物的标本，比较二者有无偏差，并了解干扰物浓度与偏差程度的关系。(2)用病人标本作偏差分析。选择病人标本，如心脏、肝脏和肾脏疾病患者，用过某种可能有干扰的药物的病人，以及含有高胆红素、高血脂和血红蛋白的标本，用参考方法和试验方法同时测定，将试验方法的结果和参考方法比较，以确定有否干扰和干扰程度。这两种干扰试验各有优缺点。第一种方法的不足之处是实验标本的介质可能与病理标本的介质不尽一致；病理标本中的干扰物可能不是原来的药物而是代谢产物；加入的干扰物可能与病理标本中的干扰物不完全相同等。第二种方法的不足之处为：（1）病人通常用多种药物，难以确定干扰物；（2）不是每种测定项目均有参考方法，而且有的参考方法难以在临床实验室中开展；（3）参考方法亦可能受某些物质的干扰。如果结合两种方法同时使用，将会起到互补作用。四、EP-9用患者样本进行方法对比及偏差评估EP-9文件是美国临床实验室标准化委员会标准化系列文件之一，此文件提供了对比实验方法：用患者血清标本，采取两种方法（试剂或仪器）分别进行双份测定，然后将分析所得数据进行相关回归等分析，计算两方法间的偏差。实验室工作中，常常会有一些新的方法、试剂或仪器投入使用，在使用这些新的方法、试剂或仪器之前，则需要对其进行一些评价，其中一项是和参考方法进行对比实验，以确定此方法测定的结果偏差在允许范围内。或者在评价同一分析项目的两种分析方法间的偏倚时，也要做对比及偏差分析。对于实验样本要求为：（1）来源于健康人或患者，无干扰，尽量避免储存；（2）测定物浓度范围应在医学决定水平范围内均匀分布；（3）样本数至少40例，增加数量能提高可信性。对比方法采用厂家要求的实验室常规方法或公认的参考方法。使用线性回归方程计算预期偏倚及可信范围并计算偏倚。五、EP-10定量临床实验室方法的初步评价在新方法、新试剂、新仪器用作体外诊断前，常常有必要对它的可接受性作出初步决定。这个初步的方法性能检查，既不是对方法长期性能的严格评价，也不是评价影响设备产生结果的多种因素。本标准的首要目标是有助于发现问题，并要求立即予以纠正，或询问厂商，或作进一步评估。EP-10文件规定了一种对临床检验方法的线性、偏倚、线性漂移、样品交叉污染和精密度作初步评价的方法。在新方法用于检测病人样品前、或者在对方法作任何改进后，必须进行初步评价。这些试验原意是用于自动化仪器的评价，但也可用于试剂盒、手工方法或其他体外诊断设备的评价。只做10例样品的重复实验，通过绘制实验点，作一些简单的计算，即可评价性能特性。使用多元线性回归分析统计技术，可进一步获取影响不精密度因素的信息（如样品交叉污染和线性漂移）。因为提供了简单数据分析的说明，所以无需使用计算机。本实验用于仪器性能特性的初步评估，以确定设备最终的可接受性，实验结果仅可确定设备是否具有严重的不可接受性能。EP-10文件也阐述了定量临床实验室方法的初步评价中所用的材料和方法。此初步实验可能有多方面的改变（如延长实验天数、剔去有问题的样品），且随设备的复杂性、方法的特性和用户的有用资源而改变。六、EP-12定性检测性能评价定性实验（qualitativetests）仅给出阳性或阴性（是或非）的实验结果。在临床实验室中使用一项新的定性检验方法可以有许多理由，如使用简便、低成本、操作过程规范或能满足使用者的特殊要求。但在使用新方法进行患者样本检验前，使用者必须进行相关的实验准备工作，包括与其它方法的比较、使用培训人员、正确采集标本和必要的室内质量控制过程等。对定性实验方法进行评价时，使用患者样品进行重复性实验和方法比较是非常重要的内容。在临床实验室中，定性试验可用于筛查、诊断、确认、或监测为目的的测定。试验的敏感性、特异性、预测值和效率等，决定了其在临床应用的范围。临界值（cutoff）是实验结果处于（阴、阳性）分界点时的样品中分析物浓度值，低于此值，定性实验的结果为阴性，高于此值，定性实验的结果为阳性。对定性实验来讲，临界值是唯一的医学决定水平，当样品中被测物浓度处于临界水平时，定性实验重复检查同一样品，将产生50%的阳性结果和50%的阴性结果。当样品浓度在临界值以上增加时，阳性结果比率增加；而当样品浓度在临界值以下减低时，阴性结果比率增加。在评价实验期间，应做好质量控制工作，以保证实验在预期的质量目标下进行和实验数据的有效性。质控物可使用试剂生产者推荐的阴性和阳性质控物。重复性评价实验可以与方法学比较实验同期进行。重复性评价实验应该提供样品浓度接近临界值时的精密度结果，而用远低于或高于临界值浓度的样品进行定性实验的重复性评价是不适当的。在临界值95%区间之外，定性方法给出相同测定结果的能力（阴性或阳性）是评价其方法性能的重要指标。定性实验方法的重复性评价目的是确立被评价方法的临界值，进一步确立临界值±20%的样本浓度范围是否在该方法临界值95%区间内七、EP-14基质效应的评价基质效应是指检测系统检测样品中的分析物时，处于分析物周围的所有非分析物质对分析物参与反应的影响。产生基质效应的原因与以下四个主要因素的相互作用密切相关：仪器的设计、试剂的组成成分、测试方法的原理、质控材料的组成及处理技术等。通过回收实验可以评估分析方法是否受基质效应的影响，EP-14文件介绍的方法就是评估经过物理或化学方法处理过的样本在分析过程中是否存在基质效应。基质效应评价的实验步骤包括：（1）按产品说明书的步骤准备处理样本。（2）将处理过的样本随机排列在20份新鲜的患者样本之中，用待评估方法对患者样本、处理过的样本进行检测。再将上述过程重复2次，每个样本共得到3个结果。实验过程中最好将3批次的重复检测连续完成，因为这样可以减少结果漂移等对实验结论的影响。此外，每批检测前都应重新定标。（3）用对比方法对20份新鲜的患者样本、处理过的样本进行检测，步骤同上。（4）将20份患者样本和处理过的样本冷冻保存（最好是－70℃）以便进行后续研究，如果在数据分析中和分析后出现任何问题，则可用其他对比方法如NRSCL的决定性方法或参考方法检测这些样本。但是应该注意的是，冷冻可能导致粘蛋白、酶结构发生改变而引入基质效应。八、EP-15精密度和准确度性能的核实实验室方法学性能要求包括精密度和准确度两方面，之前这两方面属于生产商验证内容。EP-15属于EP-5（定量实验精密度评估方法）和EP-9（用患者样本进行方法对比及偏差评估）的附属文件。EP-5和EP-9文件强调对于性能要求的建立和验证，而此文件重点在于验证实验室性能是否能合乎要求。精密度指在某一个量的多次观测中，各观测值之间的离散程度。精密度反应的是相同浓度的样品平行测定的接近程度。若观测值非常集中则精密度高；反之则低。精密度性能的用户核实应注意：1）实验至少要做5天，每批每个水平(要求2个浓度水平)作4次重复检测。利用方差分析进行数据统计；2）计算批内不精密度(CV或SD),并将与厂家批内不精密度比较；3）计算总不精密度(CV或SD)，并将与厂家总不精密度比较。或者将总不精密度与不精密度分析目标进行比较。准确度是指在对某一个量的多次观测中，观测值对该量真值的偏离程度，观测值偏离真值愈小，则准确度愈高。准确度的用户核实应注意：1）选择20份患者的新鲜标本，它们内含的分析物浓度分布于实验方法的可报告范围。不使用分析物浓度超出可报告范围的样品。2）两个方法对标本检测应在同1天的4小时内完成。如果实验安排3～5天，每天进行57份标本检测，这样得到的结论是最可靠的。九、C-28临床实验室如何定义和确定参照区间对临床实验室数据的解释是一个综合性的决策过程，对一名患者样品测出的结果，需要与一定的参考区间进行比较，以做出医学诊断、治疗决定、或对健康状况做出评估。因此，临床实验室在进行检验工作的同时，为实验室定量测定