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第7章细菌的遗传分析本章主要以大肠杆菌为材料，讨论：1、细菌的遗传物质的传递规律2、细菌染色体作图3、细菌同源重组的分子机制7.17.1.1细菌的细胞和基因组细菌的细胞细菌:真细菌（eubacteria）如大肠杆菌（Escherchiacoli）古细菌（archaebacteria）如詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannasch）多种形态存在：球菌（cocci）杆菌（bacilli）螺旋菌（sprilla）等大小：随种类不同而异杆菌一般长1～5㎛，宽0.5～1㎛；球菌以直径大小表示，一般为0.5～1㎛；螺旋菌一般长为1～50㎛，直径为0.5～1㎛细菌结构简单：其基本结构，包括细胞壁、细胞膜、拟核、核糖体、细胞质及内含物；特殊结构如荚膜和鞭毛世代时间短，20分钟一代，容易得到生化突变型。单细胞，遗传物质环状核酸分子——基因带/线（genophore）也可称染色体。单细胞→菌落（clone）/菌株（strain）野生型菌株原养型prototroph营养缺陷型auxotroph细菌与细菌之间可有遗传物质的交换细菌染色体不凝缩，没有着丝粒，也没有纺锤体结构。细菌繁殖：双链环形DNA分子随着细胞伸长而采取二分分裂（binaryfission）的方式分开。7.1.2细菌的基因组细菌染色体大多为裸露的环状闭合DNA双链，没有组蛋白和其他蛋白质结合，也不形成核小体结构。位于细胞内一个称为“拟核”（nucleoid）的区域中。这种结构有利于外源DNA的插入。细菌的染色体长度为250～35000μm不等。（1）拟核结构电镜观察表明：拟核结构最显著的特征是其DNA被包裹压缩成一个个有序的环状结构域(loopdomain)。大肠杆菌基因组长4.7×106bp，在松弛状况：1300μm长，是其细胞长度的1000倍，必须压缩最少1000倍后才能装入细胞中。对拟核成分分析表明，DNA占80％，其余为RNA和蛋白质。已分离出HU、H1等DNA结合蛋白，类似于真核染色体的结构蛋白，可能与结构域的形成有关。大肠杆菌拟核中约有100个结构域，每个相当于40kb，各个结构域具有相对的独立性。染色体(拟核)的结构域是超螺旋结构。这是DNA双螺旋的螺旋轴盘绕而形成的螺旋，是DNA三级结构的一种形式。如果用DNA酶处理大肠杆菌拟核中，各结构域DNA链将会断裂，超螺旋结构受到破坏，变为松弛型结构。拟核的中央部分为支架蛋白和RNA。若用RNA酶处理，拟核中DNA的折叠结构即不能保持，说明RNA和支架蛋白是保持拟核结构的重要因素（2）E.coli基因组概况E.coli的染色体为闭合双链环状DNA，长约1333um.1997年测定完成E.coliK-12MG1655菌株全基因组:4,639，221（约4.7×106）bp其中：87.8％编码蛋白质0.8％编码稳定性RNA0.7%无编码功能的重复序列11％属调节序列和具有其它功能在编码蛋白质序列：总共编码4288种已知和未知的蛋白质（可读框），其中约38％功能不明。在K-12MG1655菌株中，基因的平均长度为950bp,基因之间的平均间隔约为118bp，但是菌株之间可能会有很大的差别。2005年报道了第二个菌株E.coliK-12W3110基因组的完整序列。比较K-12MG1655菌株和K-12W3110菌株，发现两者基因组大小并不是一致的。K-12W3110基因组大小为4，646，332bp基因总数为4464个K-12W3110与K-12MG1655两者相同的基因为4453个Fig17.14AmapoftheE.coligenome,showingselectedgenes.©2003JohnWileyandSonsPublishers7.2大肠杆菌的突变型及其筛选7.2.1大肠杆菌的突变类型（1）合成代谢功能的突变型（anabolicfunctionalmutants）野生型品系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必需的复杂有机物的功能，这称为合成代谢功能（anabolicfunction）。这需要大量基因的表达，其中任何一个必需的基因发生了突变都不能进行一个特定的生化反应，从而阻碍整个合成代谢功能的实现，这种突变型称为营养缺陷型。它们多是条件致死突变（conditionlethalmutation），因为能通过在基本培养基中添加所需的有机成分使具有这种突变的细菌存活。（2）分解代谢功能的突变型（catabolicfunctionalmutants）野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，因为它能使复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能将复杂分子，如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间物。这些降解功能称为分解代谢功能（catabolicfunction）。同样，一系列降解功能的实现也需要许多有关基因的表达，其中任何一个基因的突变都会影响降解功能的实现。如Lac－突变型不能分解乳糖，因此就不能生长在以乳糖为唯一碳源的基本培养基中，而野生型Lac＋细菌都能利用乳糖。Lac－表型可能是因为lacZ＋或lacY＋基因发生突变，分别产生了基因型为lacZ－或lacY－的突变型菌株。这种菌株显然亦是条件致死突变型。（3）抗性突变型（resistantmutants）细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗生素产生抗性（resistant），对噬菌体的抗性突变往往是以某种方式改变细菌的膜蛋白，从而某种噬菌体不能吸附或吸附在这种突变细菌上的能力降低。对抗生素产生抗性的突变是一个严重的公害问题，所以研究得也较深入，而且细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。如对链霉素抗性突变的细菌是由于核糖体的30S亚基的S12蛋白变异，链霉素能和敏感细菌（野生型）的S12结合，从而使翻译过程发生差错或者使翻译过程的启动作用失效。而抗链霉素突变型的S12不再和链霉素结合，因此抗性突变细菌可以在链霉素存在的情况下，进行正常的翻译作用和正常的分裂繁殖。7.2.2细菌的培养与突变型筛选影印培养法（1）接合（conjugation）：通过供体与受体之间的接触而传递DNA（2）转化（transformation）：是指游离的细菌DNA片段被吸收到不同的细菌细胞内（受体）。（3）转导（transduction）：是指一种细菌的DNA片段经过温和的或经有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌。7.3细菌的遗传分析细菌中，大肠杆菌（E.coli）最为广泛的遗传学实验材料细菌的遗传重组可以通过三种途径来实现：1946年杂交实验Lederberg&Tatum，E.coliK12strain首次证明E.coli的有性生殖和基因重组。7.3.1接合（Bacterialconjugation）经细菌细胞直接的接触，把一个细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体），从而实现遗传重组。（图8－3）接合能传递大段的DNA，在细菌的遗传重组中是效率最高的。(1)细菌经典的杂交实验细菌的杂交最初是在E.coli中发现的菌株A：met-bio-thr+Len+tai+甲硫氨酸生、苏、亮、硫胺菌株B：met+bio+thr-Len-thi-将A和B混合培养在完全培养基上过夜→离心→倒上清（完全培养基）→水洗沉淀下来的细胞→涂布在基本培养基上（108cells/皿）结果：基本培养基上大约107个亲体细胞就会出现一个met+bio+thr+Len+thr+原养型菌落。而分别培养在基本培养基上的，未经混合的两个亲体品系作为对照没有产生原养型菌落。这说明原养型菌落的产生，一定是A菌株的thr+Len+thi+和B菌株met+bio+的基因结合在它的基因组里了。1×10－7是一个很低的数值，从一千万个细胞中挑出去一个，在果蝇等遗传实验材料中很难做到这一点。问题：1.这种与亲代不同的能在基本培养基上生长的细菌不一定是基因型的改变，可能是培养上的互补，即一些物质从一个品系的细胞中泄漏出来而被另一个品系的细胞所吸收呢？2.还是另一种可能，是基因型的改变，但不一定是由于两个品系间的杂交，而是一个品系的DNA片段逸出细胞后，携带着相应的基因（如met+bio+）进入另一个品系的细胞，因为这种转化作用而产生了上述的营养型？回答以上问题：1950年Davis：U型管实验，有力地支持了细菌菌株杂交的判断。他用一个U型管，在底部用一块过滤器隔开，把管分隔为相等的两臂。滤器的孔很小，细菌不能通过，只有象DNA这样0.1微米的游离分子、培养液和营养物质可以通过。U型管两臂中分别为营养缺陷型品系A和B，使它们繁殖到饱和状态，同时在U型管的一端交替地吸（suctoin）和压（pressure），使两臂中的培养液充分混合，但细菌的两个品系的细胞却不会接触。在U型管中培养一些时间后，再从两端分别取细菌进行培养，没有发现一个细菌能在基本培养基上生长。结论：要有原养型细胞的形成，两个菌株间的直接接触是必不可少的。（Requirementforphysicalcontact）StrainAmet-bio-thr+Leu+thi+met+bio+thr+Leu+thi+StrainBmet+bio+thr-Leu-thi-met-bio-thr-Leu-thi-(recombinants)?Lederberg和Tatum根据实验作解释，认为上述原养型是两个亲本品系基因的重组体。在E.coli中基因重组经一系列步骤进行：（1）细胞融合；（2）亲本细胞的遗传物质经过融合形成二倍体合子；（3）遗传物质发生交换的合子经过减数分裂产生了带有重组基因的子代细菌。这个解释的实质是：在两个亲本细菌之间，就象真核细胞的有性过程一样，发生了杂交和遗传物质的交换，产生了基因重组体。用基因符号图解表示：(2)（E.coli）遗传物质的单方向（one-way）转移上述的解释虽然比较正确，但其中有一点却被Hayes的一个意外发现所否定。Lederbery和Tatum认为两个亲本细菌在基因重组过程中起着同等作用－E.coli的性系统是同宗配合（homothallic）。Hayes则证明：E.coli遗传物质的传递方式与具有典型减数分裂的生物不同。例如：两个亲本类型对后代的遗传贡献并不相等，有些亲本基因的组合会在后代出现，有一些则不会出现，而且所有后代中出现的基因都是连锁的，因此，E.coli的有性过程应该是异宗配合的（heterothallic）。Hayes做了一个杂交实验，用的品系与Lederbery和Tatum用的相似，即：品系A：品系B：met-thr+Leu+thi+met+thr-Leu-thi-在杂交前，将品系A用高剂量的链霉素处理（链霉素并不立即杀死它们，只是阻碍细胞的分裂）①Streptomycin处理A×B基本培养基原养型重组体②对照A×BMM原养型重组体③A×streptomycin处理BMM无原养型重组体产生处理Hayes认为：E.coli遗传物质的重组不是交互进行的，而是一种单向转移的结果，其中品系A作为遗传物质的供体（Donor），品系B的细胞则是遗传物质的受体（Recepter）。当两个亲本细胞接触后，供体品系A的遗传物质进入受体品系B的细胞中，紧接着A和B品系遗传重组现象就在受体品系B的细胞中发生。供体品系相当于雄性，受体品系则相当于雌性。7.3.2F因子（Fertilityfactor）1953年，Hayes获得证据:E.coli的遗传交换仅供体细胞→受体细胞。提出在E.coli两个品系间遗传物质的转移是通过一个SexfactorF(afertilityfactor，致育因子)因子介导实行的。供体细胞有F因子→F＋受体细胞缺乏F因子→F－现在已经证实F因子是一种质粒（plasmid）,能够自我复制的环状DNA分子，作用象一个微型染色体（minichromosome），包含约接近100个基因。F因子的重要性质：（1）F因子能够复制它的DNA，使它能够保持在正在分裂的细胞群体中（a）（2）携带F因子的细胞产生伞毛（pili）－微小的蛋白质表面管（minuteproteinaceoustubules），使F＋细胞能