DB51T 676-2007 牛奶中氯霉素残留检测方法-高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法

ICS：65.020.30备案号：四川省地方标准DB51/T676—2007牛奶中氯霉素残留检测方法－高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法Determinationofchloramphenicolresiduesinmilkbyhighperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry2007-03-17发布2007-05-01实施四川省质量技术监督局发布DBDB51/T676—2007I目次前言.............................................................................II1范围................................................................................12规范性引用文件......................................................................13制样................................................................................13.1样品的制备.........................................................................13.2样品的保存.........................................................................14测定方法............................................................................14.1方法提要或原理.....................................................................14.2试剂和材料.........................................................................14.3仪器和设备.........................................................................24.4测定步骤...........................................................................24.5结果计算和表述.....................................................................35检测方法灵敏度、准确度、精密度......................................................45.1灵敏度.............................................................................45.2准确度.............................................................................45.3精密度.............................................................................4附录A（资料性附录）氯霉素特征离子质量色谱图、特征离子质谱图.....................5DB51/T676—2007II前言本标准按GB/T1.1—2000《标准的结构和编写规则》进行编制本标准附录是资料性附录本标准由四川省畜牧食品局提出并归口本标准由四川省质量技术监督局批准本标准起草单位：四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所本标准主要起草人：彭莉、岳秀英、高岚、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚DB51/T676—20071牛奶中氯霉素残留检测方法－高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法1范围本标准规定了牛奶中氯霉素残留量检测的制样和高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）测定方法。本标准适用于牛奶中氯霉素的残留量测定。检出限为0.05µg/L。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T1.1-2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则(ISO/IECDirectives,Part3,1997,RulesforthestructureanddraftingofInternationalStandards,NEQ)GB/T6682-1992分析实验室用水规则和试验方法农牧发[2003]1号兽药残留试验技术规范（试行）3制样3.1样品的制备取适量新鲜的空白或供试牛奶，涡旋混合使之均匀、密封。3.2样品的保存-20℃以下冰箱中贮存备用。4测定方法4.1方法提要或原理牛奶中的氯霉素用乙酸乙酯提取，正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化，氮气吹干。用高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。4.2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.2.1氯霉素标准品（CAP）含氯霉素(C11H12Q5N2Cl2)不得少于97%4.2.2乙酸乙酯4.2.3乙腈色谱纯4.2.4甲醇色谱纯4.2.5正己烷4.2.6氯化钠4.2.7氯霉素标准贮备溶液取氯霉素标准品约10mg，精密称定，用甲醇溶解并稀释成浓度为100µg/mL的标准贮备液，置-20℃保存，保存期不超过一年。4.2.8氯霉素标准溶液准确量取氯霉素标准贮备溶液适量，用50%乙腈稀释成浓度为5µg/L的标准溶液，置4℃冰箱中保存，保存期不超过一个月。4.2.94%的氯化钠溶液称取40.0g氯化钠，加水稀释成1000mL,摇匀即得。DB51/T676—200724.2.10WatersSep-PakVacC18固相萃取柱或相当者500mg，3mL。临用前分别用5mL甲醇和5mL水预处理，保持柱体湿润。4.3仪器和设备4.3.1液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）或相当者4.3.2实验室常规仪器设备4.3.3天平感量0.01g4.3.4分析天平感量0.00001g4.3.5漩涡混合仪4.3.6振荡器4.3.7组织匀浆机4.3.8冷冻离心机4.3.9固相萃取装置4.3.10旋转蒸发仪4.3.11氮吹仪4.3.12离心管50mL、20mL4.3.13微孔滤膜0.22µm4.4测定步骤4.4.1试料的制备试料的制备包括：——取冷冻样品于室温解冻，将解冻后的样品于-8℃，6000r/min离心20min，作为供试样品。——取冷冻空白样品于室温解冻，将解冻后的空白样品于-8℃，6000r/min离心20min，作为空白样品。——取空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加样品。4.4.2提取取10.0mL供试样品，置50mL离心管中，加入20mL乙酸乙酯提取，震荡15min，以6000r/min离心10min，将乙酸乙酯层移至鸡心瓶中。再加20mL乙酸乙酯同法操作，合并两次乙酸乙酯提取液至鸡心瓶中，于45℃水浴中减压旋转蒸发至干。4.4.3净化加10mL4%氯化钠溶液于鸡心瓶中，充分旋涡溶解残留物，加5mL正己烷振荡混合1min，静置分层，弃去正己烷。再加5mL正己烷，同法操作。水层为样品备用液。用5mL甲醇、5mL水淋洗活化C18柱，弃掉洗涤液。取上述水层备用液，以每3～4秒1滴的流速通过预处理后的C18柱，用5mL水洗柱，弃去洗液，抽干。用5mL甲醇洗脱并收集洗脱液，氮气吹干，用1mL50%乙腈溶解残余物，充分涡旋，用0.22µm滤膜过滤，滤液供高效液相色谱-串联质谱仪测定。4.4.4标准曲线的制备准确量取适宜浓度的氯霉素标准容液，添加到通过提取、净化后的空白样品洗脱液中，用氮气吹干，用1mL50%乙腈溶解残余物，充分涡旋，用0.22um滤膜过滤，，制得浓度为0.20µg/L、0.50µg/L、1.0µg/L、2.0µg/L、5.0µg/L、10.0µg/L的系列标准工作溶液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。4.4.5测定4.4.5.1液相色谱条件色谱仪：Waters_2695高效液相色谱仪或相当者色谱柱：AtlantisTMC18(2.1mm×150mm，5µm)或相当者柱温：30℃流速：0.2mL/min进样量：20µLDB51/T676—20073运行时间：15min流动相：A：乙腈，B，水GradienTableTime(min)FlowRate(mL/min)A(%)B(%)CurveInitial0.22080160.29010680.290106150.2208014.4.5.2质谱条件质谱仪：WatersQuattroPremierXE或相当者电离模式：ESI-扫描方式：负离子扫描检测方式：多反应检测电离电压：2.8KV源温：120℃雾化温度：350℃。锥孔气流速：50L/h；雾化气流速：450L/h；数据采集窗口：15min驻留时间：0.2sec定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压见表1表1氯霉素定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞电压药物定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)锥孔电压(V)碰撞电压(V)氯霉素（CAP）321/152321/1523015321/257134.4.5.3测定法取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积计算，即得。对照溶液及试样溶液中氯霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液的总离子流和选择离子流图分别见附录A中图A.1。4.4.6空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4.5结果计算和表述按下式计算试样中氯霉素的残留量：式中:X——试样中氯霉素的残留量(ng/mL)；A——试样溶液中氯霉素的峰面积；AS——标准溶液中氯霉素的峰面积；ACsVX=————AsV0DB51/T676—20074cs——标准溶液中氯霉素的浓度(ng/mL)；V——溶解残余物的体积(mL)；V0——供试牛奶试样的体积(mL)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5.1灵敏度本方法在牛奶中的检测限为0.02µg/L，最低检出限为0.05µg/L。5.2准确度本方法在牛奶中0.05µg/L～0.2µg/L添加浓度的回收率为50%～120%。5.3精密度本方法的批内变异系数CV≤14.8%；批间变异系数CV≤23.9%。DB51/T676—20075附录A（资料性附录）氯霉素特征离子质量色谱图、特征离子质谱图0.5ng/ml0228Time2.004.006.008.0010.0012.0014.00%12.004.006.008.0010.0012.0014.00%12.004.006.008.0010.0012.0014.00%2std-CAP-28-2MRMof2ChannelsES-3212573.11e38.106.816.57std-CAP-28-2MRMof2ChannelsES-321152.13.94e38.1310.66std-CAP-28-2MRMof2ChannelsES-TIC6.98e38.106.816.578.36图A.1氯霉素标准溶液特征离子质量色谱图图A.2氯霉素特征离子质谱图