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高效液相色谱——亲和色谱定义亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色普可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去处或减少混合物中某一分子的含量。原理将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。亲和作用亲和作用：生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用。特异性亲和体系高特异性抗原-单克隆抗体荷尔蒙－受体蛋白核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白酶－底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－辅酶凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质-肝素酶、蛋白质-活性色素（染料）酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）基本特点优点：1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高；2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高。缺点：1、价格相对较昂贵；2、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件；3、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。影响因素上样体积---若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。柱长------亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果亲和介质的载量高，与目标产物的作用力强，可以选择较短的珠子；相反，则应该增加柱子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。流速---亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢，保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间结合力弱和样品浓度过高时。温度---温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲和力，充分地结合；而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行洗脱。分类名称作用原理应用免疫亲和色谱抗原与抗体专一性识别抗原或抗体固定化金属亲和色谱锌、镍离子与蛋白表面组氨酸特异性识别含有组氨酸的蛋白染料亲和色谱染料与蛋白之间的特异性识别激酶、脱氢酶核苷酸亲和色谱核苷酸与蛋白之间的特异性识别激酶、脱氢酶凝集素亲和色谱凝集素与糖之间转移性可逆结合糖蛋白蛋白亲和色谱对类似的抗体的转移性免疫蛋白等找与底物专一可逆结合的配基；将配基通过共价键偶联到基质；配基与底物吸附；洗脱目标物。操作流程例子免疫亲和色谱抗原和抗体的作用具有高度的专一性,并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到吸附剂上,便可有效地分离和纯化免疫物质。特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲和配基不稳定，容易降解。解析方式特异性解吸——半抗原置换非特异性解吸——调节pH值、加入试剂破坏氢键、引入离子对、加入表面活性剂、冷蒸馏水洗涤。纯化血小板第4因子(PF4)用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中纯化血小板第4因子(PF4)。将单克隆抗体Sz-95-LgG与溴化氰活化的Spharose4B凝胶连接成亲和色谱柱,人血小板破碎液经此亲和色谱柱上样后,经洗脱获得PF4。结果表明,Sz-95-Sepharose4B亲和色谱柱的偶联率为72%,每1mL血小板破碎液中可以纯化到PF418μg。基因重组融合蛋白的纯化