抗体的研制及其在生物医学中的应用11208120杨文清

抗体的研制及其在生物医学中的应用11208120杨文清抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点，在各种疾病治疗，特别是肿瘤治疗领域的应用前景备受关注。当前，抗体药物的研究与开发已成为生物技术药物领域研究的热点，居近年来所有医药生物技术产品之首。一、背景历史：1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白。1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。单克隆抗体的研究一直是生物医药领域的重要研究内容。白20世纪90年代中期以来，单克隆抗体和多克隆抗体的基础研究论文产出有所下降，而人源化抗体的研究则不断得到重视(参见图1)。这说明，单克隆抗体相关生物医学理论的基础研究已经相对成熟，单克隆抗体应用研究则不断发展。在这一研究发展历程中，人源化抗体和重组多克隆抗体技术的发展促进了抗体药物研究的深入(参见图2)。其中，人源化抗体是在鼠源单抗应糖体展示技术、酵母展示技术、转基因鼠技术等的发展，使人源性基因工程抗体的获得不再是难题．这又激发了单抗药物的研究热情。1994年．美国批准第二个抗体药物上市。之后，抗体药物不断上市。2006年利用能够产生人类抗体的转基因小鼠XenoMouse技术首个完全人源化单克隆抗体药物Panitumumab上市，标志着人源化抗体技术的发展达到了新的水平。近年来，随着Symphoge公司的Symplex和Sympress等技术的发展．以及由此而生产、用于治疗原发性血小板减少性紫癜(ITP)和新生儿溶血症(HDN)的多克隆抗体药物Sym001(anti—RhD)进入II期临床试验重组多克隆抗体药物研究也呈现出良好的发展态势。二、技术知识：抗体制药工程主要基于抗原抗体反应。抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇（表位）和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。除两者分子构型高度互补外，抗原表位和抗体超变区必须密切接触，才有足够的结合力。抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当温度、pH、电解质和补体影响下，出现沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合介导的肉眼可见的反应，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。在血清学反应中，以上两阶段往往不能严格分开，往往受反应条件（如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等）的影响。1.单克隆抗体技术：单克隆抗体技术是1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学奖。1984德国人G.J.F.Kohler、阿根廷人C.Milstein和丹麦科学家N.K.Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理医学奖。单克隆抗体原理：要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。1975年，Kohler和Milstein运用这种技术，获得了抗绵羊红细胞的单克隆抗体，而经30多年的发展，抗体技术经历了鼠源性单克隆抗体、嵌合体单克隆抗体、人源化和全人源化4个阶段（如下图）。2.重组多克隆抗体技术：微生物入侵后机体的反应是B淋巴细胞激活抗原反应和克隆性扩张。一旦进入浆细胞（产生抗体的细胞），细胞的每一克隆将分泌其特异抗体，因此入侵的病原体将遇到能在其表面许多不同位点结合的一连串抗体分子。这种多克隆反应，其特异性及亲和力范围随时间而改变，对抗感染是理想的。第3代抗体治疗药，重组多克隆抗体，瞄准第1，2代抗体治疗药的缺点，模拟天然免疫方式，能与任一抗原的数种不同表型结合。因而重组多克隆抗体接近多靶点表型，相信能触发更多效应器功能，包括调理作用（加强抗原的内吞），位阻（抗原外包抗体防止与宿主细胞或粘膜表面接触），中和毒性，凝集或沉淀（抗体与数种可溶性抗原结合引起凝集和然后的消除），激活补体和抗体依赖性细胞毒性（使自然杀伤细胞和中性粒细胞杀死靶细胞）。mAb丧失抗高突变靶标的作用，包括发生随机突变的病毒，因而逃避免疫系统。而病原体逃避一个多克隆反应的可能性较小，故重组多克隆抗体可为感染疾病提供较好的治疗。另外，重组多克隆抗体技术在病毒毒株变异时仍能较好地保持治疗活性。重组多克隆抗体还有超过经典血浆提取免疫球蛋白的许多优点。传统免疫球蛋白中有靶特异治疗作用的抗体只占全部注射抗体的一小部分，浪费了大量的球蛋白，增加了组织交叉反应和副作用。重组多克隆抗体较纯、较特异，可以克服以上缺点。理论上，各种抗原靶标均可产生重组多克隆抗体，没有血清提取产品那样的限制。最后，新一代抗体不携带病毒，无转染危险，故改善了安全性。3.基因工程抗体：基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的生物药物总称。借助DNA重组和蛋白质工程技术，在基因水平对免疫球蛋白分子进行切割、拼接、修饰和重新组装的一种新型抗体。所制备的抗体去除或减少了可引起副作用的无关结构，但保留天然抗体的特异性和主要生物学活性，并可赋予抗体分子以新的生物学活性。三、前沿技术：1．抗体的高通量、大规模制备技术：常用的技术包括杂交瘤快速筛选技术、抗体库技术和记忆B细胞分选技术等。近年来又有新的发展。Uhlen和Ponten建立了高通量的单一性多克隆抗体制备技术。Bernasconi等改进了人记忆B细胞分选技术，用CpG寡核苷酸增加了B细胞永生化率，从而使单抗制备更加快捷有效。美国Epitomic公司发展了兔杂交瘤技术，克服了鼠杂交瘤的缺点，可获得更多的低丰度及磷酸化蛋白质抗体。另外B细胞表达Bcl-2转基因鼠结合多位点重复免疫（RIMMS）的方法，可增强保守抗原单抗的产生。2.抗体功能化制备新技术：抗体功能化制备技术是针对抗体药物应用研究的新概念，通过抗体库筛选及功能化重组技术，进一步提高抗体药物效果。主要包括重链抗体库和多功能重组技术。重链抗体是来源于骆驼科动物体内的轻链天然缺失抗体，其重链可变区（VHH）能够单独形成完整的抗原结合位点，具有相对分子质量小、易表达、特异性高、亲和力高、溶解性高、多样性好、能识别独特构象抗原表位等优点，能有效地拮抗酶功能、中和毒素，是功能性抗体发展的新类型。自1984年第一个基因工程人-鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体层出不穷，包括单价小分子抗体（Fab、单链抗体ScFV、单域抗体、超变区多肽等）、多价小分子抗体（双链抗体、三链抗体、微型抗体）、特殊类型抗体（双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体）、抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫黏连素）以及前景看好的重链抗体。基于重链抗体、人源抗体产品的基因序列，设计多功能重组片段，是目前多功能抗体研发的主要方向。目前已有出双特异性抗体、免疫脂质体、抗体融合蛋白等优点突出的不同类型产品。上海中信国健药业有限公司研制的重组人ll型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白“益赛普”已于2005年被批准上市；浙江大学研制的抗肿瘤血管生成药物血管内皮生长因子受体（VEGFR）-Fc融合蛋白正在申请进行临床研究，已被国家食品药品监督管理局受理。3.抗原表位确定技术：表位是抗原分子中几个氨基酸残基组成的特殊结构，可以被其相应抗体特异识别并结合，由5～7个氨基酸组成，最多不超过20个氨基酸残基。表位的构成方式有两种：①由某些氨基酸残基按一定顺序连续排列组成的线状序列，称为线性表位。线性表位是蛋白质分子的一级结构，比较稳定。②由分子内不连续的氨基酸残基折叠排列所形成的三维结构单元，称为构象表位。构象表位是蛋白质的二级或三级结构，不太稳定。表位鉴定主要采取竞争检测、分段表达、肽库、质谱技术及结构解析等方法。竞争检测主要是检测多个不同抗体的不同抗原表位，但并不能精确定位。分段表达主要是用原核或真核的表达方式，分段表达抗原的结构域。分段表达可以确定线性表位。合成肽库技术是在分段表达的基础上，结合表位预测，合成肽段来确定抗原表位，适用于线性表位的精确鉴定。质谱技术是限制性酶解抗原表位肽，经过质谱（如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，MALDI-TOF-MS）检测并进行数据分析后鉴定表位。质谱既可以鉴定线性表位，也可以鉴定构象表位。结构解析确定表位的方法主要包括核磁共振和X线晶体衍射技术。目前用核磁共振方法研究蛋白质的空间结构还局限于中、小蛋白质，已经确定了几百种蛋白质的空间结构；而采用X线晶体衍射技术研究抗原抗体相互作用系统中抗原氨基酸的参与识别情况以及表位类型，则可扩展到大蛋白分子。第四军医大学、军事医学科学院、北京大学北京核磁共振中心、中国科学院上海药物研究所等合作已进行了HAb18G/CD147等抗体针对抗原表位的研究。4.抗体工程药物标联及增效技术：将抗体与放射性同位素、化疗药物或毒素进行标联，既可以利用抗体的特异性靶向功能使药物分子集中作用于肿瘤细胞，提高药物疗效，又可以降低抗体或化疗药物用量，减少药物对机体的毒副作用；抗体与放射性同位素的标联物还可通过单光子发射型计算机体层摄影术用于体内定位诊断。较常用的同位素标记物有可发射高能β射线的131I和90Y等，这类同位素具有较强杀伤力；也有可发射低能β射线和俄歇电子的111In等，这类同位素具有较好的单细胞电离效应，兼具诊断和治疗两种用途；还有仅作诊断用途的99Tcm。标记逐渐趋于采用温和、长效的方法，稳定性可达72h以上。我国在该项技术方面已取得了很大进展，如第四军医大学开发的131I长效标记抗体技术和中国医学科学院开发的小分子工程抗体化学药物标记技术均已成熟，并应用于临床。抗体与化疗药物分子标联一般采用化学法，常用药物为阿霉素、卡奇霉素类等。这些标联物对结肠癌、肝癌和胃癌等多种肿瘤均有一定的抗癌效应。抗体与生物毒素的融合表达产物称为免疫毒素，生物毒素多用细菌毒素，如绿脓杆菌外毒素PE38、白喉毒素、蓖麻毒素等，多采用重组融合方式表达。免疫毒素对肿瘤细胞具有较强的杀伤效应，是很具潜力的免疫靶向治疗药物。在美国FDA批准上市的35种抗体药物中，有5种为同位素标记药物，1种为化学标记药物；而临床试验药物中，有10种为同位素标记药物，4种为化学标记药物，2种为融合表达的免疫毒素。四、产业现状：抗体药物是近年来复合增长率最快的一类生物技术药物，占现有生物技术药物研发总数的30%~35%。截至2006年，美国FDA已批准35个抗体药物，其中治疗肿瘤抗体药物占32%，免疫性疾病37%，器官移植11%，感染性疾病8%，心血管疾病4%，其他8%；按照抗体类型分析，鼠源20%（其中约70%用于肿瘤的治疗），人源化60%，全人抗体20%。在肿瘤治疗方面，应用利妥昔单抗治疗B细胞性非霍奇金淋巴瘤已达30多万例病人，单药治疗总有效率为50%，其疗效与化学药物相同，但更安全，几乎无副作用，抗体联合化疗有效率高达80%以上。另外，针对血管内皮生长因子（VEGF）的抗体药物Bevacizumab（Avastin）与化疗药物联合使用，使晚期结肠癌患者的生存期平均延长了5个月，FDA认为它几乎对所有的晚期结肠癌患者都有帮助，因此批准它作为晚期结肠癌的一线用药。该类药物一经开发就倍受关注，并创造了巨大的效益。全球抗体药物年销售额从1997年的3.10亿美元已上升到2005年的150亿美元；在生物制