《食品微生物学》实验指导书

《食品微生物学》课程课程编号：419005实验指导书主撰人曾智审核人陈跃进单位：生命科学系二O一二年六月目录前言1实验一、显微镜油浸系物镜的使用与微生物形态观察3实验二、细菌的革兰氏染色6实验三、微生物细胞大小测定和浓度测定8实验四、培养基的制备与灭菌12实验五、环境中微生物的检测17实验六、水中细菌总数检测201前言1．实验总体目标微生物学实验课是一门操作技能较强的课程。通过本课程的学习，要求学生牢固地建立无菌概念，掌握微生物实验的一套基本操作技术；树立严谨、求实的科学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力；树立勤俭节约、爱护公物、相互协作的优良作风。⒉适用专业年级生物技术专业二年级第一学期⒊实验课时分配24实验项目实验要求实验类型每组人数实验学时实验一显微镜油浸系物镜的使用与微生物形态观察必验证24实验二细菌的革兰氏染色必验证24实验三微生物细胞大小测定和浓度测定必综合24实验四培养基的制备与灭菌必综合24实验五环境中微生物的检测必验证24实验六水中细菌总数检测必综合244.实验环境在微生物学及发酵工程分室中进行，要求至少提供8套可用的仪器设备，分析天平1台，离心机1台，分光光度计1台，恒温水浴3台，高压蒸汽灭菌锅2台，超净工作台3台，恒温摇床2台，恒温培养箱2台，干燥箱1台，冰箱1台。实验室面积60M2以上，通风、照明设施良好，消防设备齐全，疏散通道正常。5.实验总体要求通过本实验课程的教学，学生能基本上达到独立完成实验内容，通过老师的指导可完成研究性实验内容，能将微生物菌种分离与鉴定、无菌操作等相关知识应用到课程设计、创新性研究、毕业论文等实践性环节中。6.本课程的重点、难点及教学方法建议（1）重点：无菌操作、微生物分离与鉴定等。（2）难点：严格按照微生物实验操作要求进行各项实验，并理解各注意事项的原因。（3）教学方法建议：注意理论与实际相结合，重视动手能力的培养和锻炼，对实2验结果的可靠性进行对照分析和检测分析。对理论性较强、较为抽象的问题、原理着重讲解，如革兰氏染色法的原理和应用。3实验一显微镜油浸系物镜的使用与微生物形态观察一、实验目的掌握显微镜低倍镜和高倍镜的使用方法，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。二、实验主要设备及材料微生物标本装片，香柏油，二甲苯，光学显微镜，擦镜纸。三、实验原理、方法和手段油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22μm。光学显微镜的成像原理（倒立的虚像）介质为空气与介质为香柏油时光线通过的比较四、实验内容与步骤（一）观察前的准备1、将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约4cm。坐正后用左眼观察。42、调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。（二）低倍镜观察染色装片首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。（三）高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。（四）油镜观察1、提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。2、从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。3、将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反方向旋转），当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。4、再次观察提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。（五）镜检完毕后的工作1、移开物镜镜头。2、取出装片。3、清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。54、擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。五、思考题1、使用油镜应特别注意哪些问题？为什么必须用香柏油？2、使用显微镜绘图时，眼睛的位置应该如何？3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？4、转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？六、注意事项及其它说明1、不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2、拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。3、下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。4、观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。使用油镜后，及时用二甲苯清洁油镜和载玻片。注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。5、注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。6、显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。6实验二细菌的革兰氏染色一、实验目的学习并掌握细菌的革兰氏染色，了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、实验主要设备及材料菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）大肠杆菌（E.coli）试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。三、实验原理、方法和手段革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。四、实验内容与步骤1、细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。2、制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。3、初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。4、媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。5、脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中最关键的一步。6、复染：滴加番红液，染色2min，水洗。7、用滤纸吸干，油镜镜检。7五、思考题影响革兰氏染色结果的最关键的因素是什么？六、注意事项及其它说明为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不宜过热，脱色时间的控制。另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。8实验三微生物细胞大小测定和浓度测定一、实验目的了解测量微生物大小的原理；学习并掌握接目镜测微尺的校正方法及微生物大小的测定方法，增强微生物细胞大小的感性认识。学习并掌握血球计数板计数的原理；掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。二、实验主要设备及材料菌种：啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）菌悬液。仪器或其他用具：显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片。其它：显微镜、血球计数板、手动计数器、擦镜纸、吸水纸等。三、实验原理、方法和手段微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具—测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和目镜测微尺。镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm，被等分为100格，每格0.01mm（即10μm）。镜台测微尺不直接用来测量细胞的大小。目镜测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将目镜测微尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专用的目镜，里面已经安放好了目镜测微尺。由于目镜测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用目镜测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。该方法是将菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间容积一定的计数室中，在显微镜下进行计数，然后根据计数结果计算单位体积内的微生物总数目。血球计数板是一块特制的9载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。常见血球计数板的计数室有两种规格：一种是16×25型，即计数室共分为16个中方格，每个中方格又分为25个小方格；另一种是25×16型，即计数室先被分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。但无论是哪一种规格的血球计数板，其计数室的小方格都是400个。我们采用的是25×16型。计数时，通常数5个中方格的总菌数，再换算成1ml菌液中的总菌数。计算公式：1ml菌液中总菌数＝5×104A·B（A为5个中方格中的总菌数，B为稀释倍数）四、实验内容与步骤（一）微生物细胞大小测定1、装目镜测微尺：取下显微镜的目镜，换上专用目镜。如果没有专用的目镜，则取下显微镜的目镜，旋下透镜，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜的隔板上，再旋上目镜透镜，将装有测微尺的目镜装回镜筒。2、目镜测微尺的标定：（1）放镜台测微尺：将镜台测微尺刻度面朝上固定在显微镜的载物台上，注意不可放反。（2）标定：将低倍镜转入光路，镜台测微尺有刻度的部分移