溶瘤病毒在肿瘤诊治中的应用

溶瘤病毒在肿瘤诊治中的应用朱华晨2015.09.29肿瘤vs病毒2/3：RNA病毒逆转录病毒，可引起爬行类（蛇）、禽类、哺乳类包括灵长类白血病、肉瘤、淋巴瘤和乳腺瘤等1/3：DNA病毒包括乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒和疱疹病毒、乙型肝炎样病毒等与人类肿瘤发生关系密切的病毒①逆转录病毒（如T细胞淋巴瘤病毒，HTLV－I）②乙型肝炎病毒（HBV）——DNA病毒③乳头状瘤病毒（HPV）——DNA病毒④Epstein－Bars病毒（EBV）——DNA病毒相辅相成，互为因果？相生相克，亦敌亦友？肿瘤vs病毒：Friendorfoe？感染性疾病研究与防治广东省高水平大学重点学科建设项目汕头大学必要性：发展现状和问题新发传染病频发，缺乏有效的应对防控方法肿瘤发生率有上升趋势，缺乏早期诊治方法学科优势缺乏有效整合，资源利用率较低粤东地区经济低迷，缺乏创新型高科技产业基础研究开发应用新病原发现与鉴定项目简介疫苗、化学药物、单抗、诊断/示踪试剂（病毒与肿瘤）新发传染病未知新病原致瘤病毒病原进化跨物种传播致病机制免疫防御协同创新人才培养学科建设平台与基地建设1.针对传统病原学方法难以在短时间内实现对新型病原体进行准确鉴定的问题，通过完善病原体高通量快速诊断平台及流行病学调查平台，提高感染性疾病尤其是新发传染性疾病的病原学鉴定、诊治以及应对突发公共卫生事件的能力，研制开发相关的诊断试剂；2.针对病毒性传染病普遍缺乏特异性治疗手段的问题，通过深入研究病原跨种属传播以及与宿主互作的分子机制，开发新型抗病毒药物和疫苗；3.针对目前肿瘤早期诊断困难、治疗特异性低下的问题，开发病毒靶向载体，用于肿瘤的示踪诊断及治疗。研究内容项目运行总体思路：研究方向新发感染性疾病的病原学诊断、生态、进化、感染机制与致病机理研究感染性疾病、炎症相关基因与肿瘤关系的研究及病毒载体在肿瘤示踪和治疗上的应用打造三个学科联合体：感染性疾病与免疫感染与肿瘤肿瘤与溶瘤病毒载体1）学科平台建设2）人才引进和培养3）基础研究4）应用开发研究5）对外交流与合作项目建设学科平台人才应用研究基础研究其他平台基地建设高通量病原快速诊断与大数据分析平台II+至III+级生物安全实验室及实验动物平台疫苗与人源单抗制备平台高通量肿瘤特异嗜杀性病毒载体筛选平台总体建设目标及社会意义整体提高我国应对新发传染性疾病的防治能力及肿瘤早期诊断与治疗的能力；全面提升我校临床医学以及转化医学水平，为我省的产业转型及升级作出具体贡献；在产、学、研的良性循环中，努力打造国内一流，在局部领域达到国际领先水平的大学。新城疫病毒与溶瘤病毒治疗2015.09.29溶瘤病毒(oncolyticvirus)Anoncolyticvirusisavirusthatpreferentiallyinfectsandkillscancercells.具有复制能力的肿瘤嗜好性杀伤型病毒溶瘤病毒(oncolyticvirus)利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终杀伤、裂解肿瘤细胞，而对正常细胞没有杀伤作用。directdestructionofthetumourcells(lysisorapoptosis)直接感染并杀死癌细胞releasenewinfectiousvirusparticles复制并杀伤更多癌细胞stimulatehostanti-tumourimmuneresponses激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死残余癌细胞优点：选择性、可自我复制、可改造、可多路径攻击癌症，同时破坏癌细胞的多种进程，并触发“旁观者机制”（安全性、耐药性、持续性？）溶瘤病毒(oncolyticvirus)天然对于肿瘤细胞具有特异性感染或杀伤能力的病毒（呼肠孤病毒、细小病毒、新城疫病毒）经人为改造（专化，强化和弱化）过，对肿瘤细胞具有特异杀伤能力的病毒（甲型流感病毒，腺病毒，麻疹病毒和单纯疱疹病毒）1：去掉毒性基因（弱化、安全）2：加上特异识别癌细胞的特殊蛋白（专化、特异）3：加入激活针对肿瘤的免疫基因（强化、效果）1991，第一个转基因溶癌病毒（HSV）报道；2006，中国批准H101上市History-usingwildtypeorattenuatedviruses1904,TheLancet：慢性白血病妇女，流感，病变白细胞减少，病情意外好转1912，Ginecologia,DrDepaceNG(Italy):宫颈癌接种减毒狂犬疫苗，肿瘤自发消退、减小1950s，西尼罗河病毒、腺病毒天然弱毒株治疗1970s，水痘病毒vs急性淋巴性白血病1970s，麻疹vs白血病、Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤-potentialriskforhighpathogenicinfectionsHistory-HSV-1GMvirusesHerpessimplexvirus1(HSV-1)起步：1991,Science,MartuzaRLetal：HSV-1,失活胸苷激酶基因（TK），裸鼠恶性脑胶质瘤U87治疗第一代：1716毒株：去除ICP34.5（γ34.5）神经毒基因，正常细胞可凋亡，病毒无法复制；肿瘤细胞IFN缺失，PKR低表达，病毒可复制并溶瘤第二代：F及G207毒株：进一步去除ICP6（编码核糖核酸还原酶大亚基），病毒无法正常复制；加入hEndo-Angio（人内皮抑素-血管生成抑素）第三代：G47Δ毒株：进一步去除α47基因，防止已感染肿瘤细胞出现免疫原性低下History-Adenovirus-GMviruses腺病毒，smallgenome，AdEasysystem,butrelativelylowreplicationONYX-015’:首个临床基因重组株（1987加州Onyx公司）；*去除E1B55KDgene，解除对p53的抑制-正常细胞：激活p53，病毒受抑制；-肿瘤细胞：p53缺失，病毒复制H101:世界上首个官方批准上市的溶瘤病毒药物（人5型Adenovirus，上海三维公司）*去除E1B55KD及非必需的E3基因-用于难治性晚期鼻咽癌（配合5-FU，顺铂姑息治疗）第二代：加肿瘤特异启动子（肿瘤特异抗原，端粒酶，生存素启动子，肝癌特异AFP启动子等）、抑癌基因（IL-24，RNApolIII-dependentU6shRNA，TRAIL）第三代：进一步去除E1B19KD,E1Abp924-947，加载抑癌基因（HCCS1等）改进：添加治疗基因（转基因治疗载体+溶瘤）History-Cowpox-GMviruses1991，CancerGenTher,MastrangeloMJetal:牛痘病毒TK中插入GM-CSF，选择性复制并激活EGFR/ras通路2006，MolTher，KimJMetal&Jennerex公司:使用全球推广的牛痘病毒惠氏株疫苗构建JX-594毒株2011，Nature，BreitbachCJetal:JX-594临床试验：首次证明静脉注射后可持续且选择性抗肿瘤大规模随机临床试验黑色素瘤转移患者III期临床试验：HSV-1(编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF)头颈部肿瘤复发患者III期临床试验：呼肠孤病毒与紫杉醇、卡铂联用针对Sorafenib治疗无效的肝癌患者II期临床试验：JX-594vs支持疗法2002实体癌I期临床试验：NDVPV701（14/62例4~30月未复发）2006恶性神经性肉芽肿I/II期临床试验：NDV2HUJ(无严重不良反应，未恶化，1例三个月内完全缓解)国外其他报导：NDV-HUJ、NDV-73T、MTH68、PV701等作为溶瘤病毒已经分别进入Ⅱ、Ⅲ期临床实验。三期临床：安进（Amgen）T-Vec；CG0070（膀胱癌）；Reolysin（头颈癌）新城疫病毒-AvianParamyxovirusType-1（Newcastlediseasevirus,NDVorAPMV-1）Group:V((-)ssRNA)Order:MononegaviralesFamily:ParamyxoviridaeGenus:AvulavirusSpecies:Avianparamyxovirus15-19kb，12serotype副流感腮腺炎麻疹仙台尼帕亨德拉副流感犬瘟APMV-1的系统发育和进化ClassIClassIIClassIIINovel禽副粘病毒属的基因组结构6个结构蛋白NP：核衣壳蛋白P：磷酸化蛋白M：基质蛋白F：融合蛋白HN：血凝素-神经氨酸酶蛋白L：大聚合酶蛋白SH：小分子疏水性蛋白IGS：非转录基因间隔区非结构蛋白特别是移码突变产生的W，V蛋白质表达可特异抑制鸡细胞的干扰素信号系统（IFNα/β拮抗剂）副粘病毒中主要基因及功能NP、P、L可形成三种复合物，NP-NP、NP-P、NP-L、P-L，参与病毒颗粒组建基因功能NP形成螺旋状核衣壳，保护RNA；N端为RNA结合域，参与核衣壳组装，C端富含磷酸化位点和抗原决定簇位点，能影响NP与模板RNA的结合；能分别与P、L以及自身组装形成复合物，参与病毒的转录与复制P与NP形成复合物后导致NP蛋白质构象发生改变，从而暴露出模板RNA，激活病毒基因组的复制M具有高度疏水性，主要连接病毒囊膜骨架与核衣壳蛋白，共同构成病毒脂质囊膜的内表面支撑物F与病毒的致病性大小密切相关，能促进病毒囊膜与宿主细胞膜之间的融合，也能使宿主细胞膜之间发生融合HN能识别并吸附靶细胞表面的唾液酸受体，也能进一步分解唾液酸受体，从而增进病毒粒子的迁移性，使病毒粒子更容易得到释放；能在病毒侵染细胞的过程中，协助F蛋白质充分接近靶细胞，从而使病毒囊膜与靶细胞膜接触进而产生融合L是RNA聚合酶的主要成分，同时也形成病毒复制与转录过程中所需要的大部分酶类，例如RNA多聚酶、Poly(A)多聚酶等History人类感染NDV后，可能出现结膜炎、淋巴腺炎、轻微流感症状或无症，很快可康复。1970，TheLancet,WebbHE&GordonCE:胃癌农场主感染NDV后胃癌痊愈2002,2006:PV701,HUJ毒株临床试验2009，IntJOncol，Wildenetal：细胞对NDV敏感性与抗病毒基因RIG-I,IRF3,IRF7,IFN-β负相关，而肿瘤细胞低表达以上因子。2011：D90抑制人非小细胞肺癌A549细胞系2012：D90荷瘤裸鼠-诱导顺铂抗性的A549凋亡（可与化疗联用）Mechanism肿瘤细胞低表达抗病毒因子，正常细胞高表达——选择性感染与复制NDV在人癌细胞中的复制是正常细胞的10000倍以上，无神经嗜性，安全强效诱导NK细胞，CD8+andCD4+效应细胞及TypeIIFN反应促进效应细胞活化与远端肿瘤凋亡，可与immunomodulatoryantibodies等系统性疗法联用灭活NDV可促进人外周血单核细胞分泌IFN-α，提高TRAIL表达，启动caspase级联反应NDV可通过分裂原活化蛋白激酶信号传导途径诱导凋亡（p38参与）致癌蛋白鸟苷三磷酸酶RacI表达帮助NDV复制及溶瘤，与肿瘤的锚定非依赖性生长有关NDV感染后不依赖于p53激发的内源性线粒体途径，而是直接改变线粒体内膜通透性，释放细胞色素-c及其他膜间隙蛋白，激活下游caspase-9形成凋亡小体，进而激活caspase-3介导肿瘤凋亡。Mechanism—HN抗肿瘤的主要分子基础肿瘤细胞高表达富含唾液酸（NDV受体）的粘蛋白Sialocmucin(膜蛋白的0.5%)NDV感染后HN可大量切除唾液酸（负电），解除masking，暴露抗原，防止逃避淋巴细胞免疫监视与攻击，减少转移HN有血凝活性，还可在肿瘤表面表达并作为粘附分子，增强肿瘤细胞表面粘附性HN可提高肿瘤细胞对淋巴细胞的共刺激作用，提高抗原递呈活性，诱导CTL（可提高淋巴细胞活性标记CD69,CD25,抗HN单抗可特异阻断此反