第六章兽药残留检测技术抗生素类

第六章兽药残留检测技术第四节抗生素类药物残留的危害分析与检测方法一、氨基糖苷类二、四环素类三、氯霉素类四、大环内酯类五、林可霉素类一、氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素是由链霉菌或小单孢菌培养液中提取,或以天然品为原料半合成制取而得的一类水溶性较强的碱性抗生素。包括链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素、卡那毒素、阿米卡星、阿布拉霉素、斑伯霉素、妥布霉素、壮观霉素等,结构式见图。由于其分子结构中都有一个氨基环醇环和一个或多个氨基糖分子,由配糖键相连接,因此最好称为氨基糖苷-氨基环醇类(Aminoglycoside-Aminocyclitol)抗生素,但因氨基糖苷类抗生素这一名称沿用已久，故仍用此名。氨基环醇氨基糖氨基糖从抗菌作用的特点看,氨基糖苷类是一类较优良的抗生素,然而,该类药物的治疗浓度范围窄,不良反应较常见,主要为肾毒性、耳毒性、神经肌肉阻滞、造血系统毒性反应和过敏性反应,其中有些是不可逆毒性。氨基糖苷类肌肉注射或静脉滴注吸收,内服后不吸收或很少吸收。与血浆蛋白结合很少,主要分布在细胞外液。肾脏皮质内药物浓度可超过血药浓度10~50倍,也可进入内耳外淋巴液,其半衰期较血浆半衰期长5~6倍。氨基糖苷类药物在体内几乎不被代谢，约90%以原形经肾小球过滤排出,尿药浓度极高,约为血浆峰浓度的25~100倍。靶组织检测物例如：卡那霉素卡那霉素对耳毒性、肾毒性的发生率较高,仅次于新霉素。卡那霉素肌注,1h血药浓度达峰值,血浆蛋白结合率很低。用药后24h内有90%的药物经肾以原形排泄。卡那霉素可透过胎盘进入羊水和胎儿循环中,在牛奶中可检测到。牛、羊、猪肌注,1日5~10mg/kg,分为2次给予,间隔12h,36h后牛奶中观测不到卡那霉素残留,肾脏中药物滞留期长。靶组织检测物链霉素、双氢链霉素链霉素和双氢链霉素对肾毒性反应稍轻,但可引起神经性紊乱,如听力减退、耳鸣或耳部胀滞、眩晕、麻木、针刺感、面部灼伤感;偶可发生生理力减退、皮疹、乏力、呼吸困难等。链霉素和双氢链霉素内服吸收差,大部分以原形随粪便和尿液排出。牛、羊、马肌注后,血药浓度于1h达到峰值。一次肌注有效浓度可维持12h。24h内,30%~90%的药物以原形经肾排出。注射部位和肾脏中链霉素残留滞留期较长,其他可食部分残留量低,停药期不必很长。乳牛肌注双氢链霉素后不久,乳汁中残留量很低,在0.05~0.13ng/g间。乳房注入不吸收,药物滞留期应予注意,以免乳汁中残留超标。靶组织壮观霉素、新霉素壮观霉素毒副作用较小,无明显的耳毒性,但可引起肝、肾和血液系统紊乱,偶可发生过敏性反应。壮观霉素主要以原形药物由肾排泄,半衰期约为2.5h。肝和肾中代谢物主要为双氢壮观霉素和壮观霉素。肝和肾中药物残留量高,滞留期约15天。新霉素几乎不被胃肠道吸收,乳腺很少吸收。药物不经胃肠道给予,体内药物生物转化很小。内服大部分以原形随粪便排出,注射吸收迅速,很快随尿液排出。新霉素在动物可食部分、鸡蛋、牛奶中药物滞留期长应予注意。靶组织靶组织（一）样品处理与蛋白质和脂类等混杂较强极性多羟基碱性水溶性不挥发氨基糖苷类抗生素性质用塑料器皿盛放难以用有机溶剂提取脱脂除蛋白液液萃取在水相中或加入离子对试剂进入有机相阳离子交换吸附剂进行固液萃取生物样品预处理生物样品预处理是除去混杂物以免污染色谱柱和干扰氨基糖苷类的分离、分析。样品的预处理包括脱脂除蛋白、提取、净化和样品浓缩。生物样品中氨基糖苷类药物仍具有水溶性质,难以用有机溶剂提取,因此首先必须用蛋白沉淀剂或固相萃取柱除去生物组织(如蛋白质、脂肪等)。含脂高的生物样品一般在提取前先除去脂类。体液样品脱脂可采用离心或正己烷提取。固态样品(如肌肉、肾、肝)处理相对复杂些,包括匀浆、提取/脱脂等步骤。除蛋白的方法：一是沉淀法,即在样品溶液中加入甲醇/盐酸溶液沉淀蛋白质。二是酸提取法,即在样品中加入三氟乙酸、三氯乙酸、三氯乙酸/柠檬酸盐、高氯酸溶液沉淀蛋白质,将生物样品与酸溶液混匀或一起均质。某些情况下,如测定肾脏中阿布拉霉素,还需用浓氢氧化氨溶液对蛋白进行水解,保证有较好的样品回收率。蛋白水解包括酸解法或碱解法,上清液再经中和。三是超滤法,经超滤法处理后的样品不会引入新的盐类污染及假色谱峰。四是固相萃取法,这是近年来在残留分析中应用最广的一种快速、简便的除蛋白方法。1、提取用高或低的pH值介质可有效提取生物样品中氨基糖苷类药物。酸性介质：三氯醋酸、三氟醋酸、高氯酸、三氯醋酸-柠檬酸或甲醇-高氯酸溶液与样品一起均质、提取。碱性介质：如甲醇-氢氧化氨溶液提取猪肾组织中的阿布拉霉素。食品中氨基糖苷类药物的提取,可加入碱性缓冲液,并加热脱去蛋白,达到提取的目的。2、净化净化方法包括液-液分配、固相萃取和基质固相分散技术(MSD)、在线痕量富集法等。有时为了达到更好的净化效果,通常将几种方法结合应用。液-液分配是将干扰组分从水相直接转移至有机相中。由于氨基糖苷类的高极性,在pH范围内不能被提取到有机相中,仍留在水相中。唯一例外的是阿布拉霉素,在辛烷磺酸离子对试剂介质中,可以用乙酸乙酯进行提取,提取回收率约90%。固相萃取法是近年发展起来的一种更有效、迅速和方便的提取及除蛋白方法。氨基糖苷类药物的浓缩和净化采用阳离子交换吸附剂较为理想,如CM-SephadexC-25、AmberliteCG-50、苯磺酸基、羧基阳离子交换柱等。正相或反相色谱吸附剂也能对样品进行提取和净化,如C18固相萃取柱净化时,提取液中预先加入适当庚烷磺酸离子对试剂,以提高氨基糖苷类抗生素的保留能力。基质固相分散技术应用相对较少柱切换技术：采用在线痕量富集技术对初提取液进行净化,在含离子对试剂的流动相中,预柱(C18柱)对链霉素和双氢链霉素进行富集,干扰组分被淋洗除去,最后待测物被洗脱进入分析柱中。与预富集过程相反,在酸性流动相中,阳离子交换柱对干扰组分有吸附作用，不被保留的壮观霉素直接进入分析柱进行分离检测。（二）分析方法1、气相色谱法气相色谱已被用于测定血清中的庆大霉素、妥布霉素、萘替米星和丁胺卡那霉素。样品脱蛋白和脱水后,用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分两步衍生化,然后用电子捕获检测器（ECD）检测。还有报道采用三氯乙酸提取和离子交换净化的方法测定牛肉组织中的卡那霉素,提取液用七氟丁酰咪唑衍生化,随后用三甲基硅烷化,GC/ECD检测,回收率为74%~86%,检测限为0.1mg/kg。2、液相色谱法氨基糖苷类药物可采用阳离子交换色谱柱或非极性反相色谱柱分离。由于氨基糖苷类药物的极性和离子特征,它们在阳离子交换柱上的分离效果较佳,在反相色谱柱上不易分离。但在反相色谱分离中,流动相中加入离子对试剂如磺酸钠或五氟丙酸,可以改善它们在C18柱上的分配性能。也可在反相柱分离前,将氨基糖苷类药物衍生化,使极性下降,以改善其在色谱柱上的分配性能。使用C8和C18分离柱,流动相一般由醋酸盐缓冲液和甲醇或乙腈组成,加入离子对试剂可以改变出峰顺序和改善峰形。高效凝胶渗透色谱法亦应用于牛奶中氨基糖苷类药物的测定。利用蛋白排阻柱(Hisep)选择性地保留新霉素(进入凝胶孔穴中),而蛋白质分子不能进人凝胶的孔穴中,随流动相由固定相间隙通过色谱柱而不被保留,达到分离的目的。检测器紫外或荧光衍生化检测方法有荧光检测、电化学检测、示差折光检测和质谱检测。大部分氨基糖苷类分子中含-NH2基团,能与邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯、1-氟-2,4-二硝基苯(FDND)等反应,形成稳定的荧光产物。最常用的以邻苯二甲醛为衍生剂,采用柱前或柱后荧光衍生化。柱前衍生反应可在溶液中进行,亦可在离子交换柱或硅胶柱的净化过程中进行。柱后衍生需要柱后衍生装置。例子：荧光衍生化HPLC法测定牛奶中庆大霉素的四种主要组分取10mL牛奶样品于4℃中离心,弃去上层脂肪层,加入1mL30%三氯醋酸,离心,上清液过C18固相萃取柱,用水、水-甲醇(1+1)和甲醇淋洗,最后用16%氢氧化铵的甲醇溶液洗脱,洗脱液挥发至干,用水溶解残余物,取部分提取液加入离子对试剂戊磺酸,进样分析。色谱柱为SpherisorbODS2(15cm,5µm),以水-甲醇(82+18)含0.1%醋酸、5.6mmol/L硫酸钠和11mmol/L戊磺酸作流动相,邻苯二甲醛柱后衍生,荧光检测,检测限为15µg/kg。二、四环素类四环素类(Tetracyclines)抗生素是一类碱性广谱抗生素。包括从链霉菌属培养物提取的四环素、土霉素、金霉素以及多种半合成四环素如强力霉素、美他霉素、米诺环素等。四环素类早在20世纪的60~70年代即广泛应用,在兽医上尤为滥用,以致细菌对四环素类的耐药现象颇为严重,一些常见病原菌的耐药率很高。四环素、土霉素等盐类,内服能吸收,但不完全,而四环素碱、土霉素碱吸收更差。四环素内服吸收不完全,约为30%~70%。血药浓度较土霉素略高,对组织的透过率亦较高。蛋白结合率65%。在胆汁中浓度可达血清浓度的5~20倍,可透入胎盘进入乳汁。水牛、黄牛、猪一次静脉注射盐酸四环素的半衰期分别为3.99h、5.39h、3.62h。休药期:牛5日,猪5日,鸡2日。土霉素内服易吸收,但不完全。一次内服后,一般2~4h达血药峰浓度,牛因部分药物进入瘤胃后延缓吸收,需4~8h才达峰浓度。吸收后广泛分布于肝、肾、肺等组织和体液中,易渗入胸水、腹水、胎畜循环及乳汁中。主要以原形从尿中排出。一部分在肝脏胆汁中浓缩,排入肠内,部分再被吸收,形成“肝肠循环”。肾功能减退时可在体内蓄积。（一）样品处理四环素类抗生素的四环母核上含有下列官能团:二甲胺基[-N(CH3)2]、酰氨基(-CONH2)、酚羟基和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统。本类抗生素是两性化合物,分子中存在酚羟基和烯醇型羟基,显弱酸性;同时含有二甲胺基,显弱碱性,故遇酸及碱,均能生成相应的盐。四环素类抗生素的游离碱,在水中的溶解度很小,其溶解度与溶液的pH值有关,在pH4.5~7.2之间时难溶于水,但若酸性或碱性增强,则溶解度增加。当pH值低于4或高于8时,可以得到高浓度的四环类化合物的水溶液。其盐类在水中会水解,当溶液浓度较大时,会析出游离碱,酸度大时能防止水解。由于四环类抗生素的分子内含有蒽酮类发色团,一般为黄色结晶性粉末,在270~360nm处有强的紫外吸收。四环类抗生素在碱性溶液中,C环打开,生成无活性的具有内酯类结构的异四环素。若在强碱性溶液中加热,几乎可以定量转化为异四坏素类产物,具有强烈荧光。液体样品(如牛奶)一般通过离心去除部分蛋白和颗粒,再用乙酸盐、磷酸盐、McⅡvaine或McⅡvaine/EDTA缓冲液稀释。组织样品(肌肉、肾脏、肝脏)提取前,样品需要剁碎或均质。1、提取从生物样品中分离四环素类比较复杂,因为这类药物易与金属离子形成螯合物,以及与组织中的蛋白强烈结合,因此须用强酸或酸性脱蛋白剂进行提取。然而,在酸性条件下(pH＜2.0),四环素类药物降解为脱水物,加热时又可转变为差向异构体。因此,提取时最好用含有EDTA、琥珀酸盐、草酸等螯合剂的弱酸性溶剂。常用的弱酸性溶剂有EDTA-McⅡvaine缓冲液(pH4.0)、琥珀酸盐缓冲液(pH4.0)、酸化乙腈、酸化甲醇。另外,三氯乙酸(pH2.0)、柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)、柠檬酸盐缓冲液/乙酸乙酯(pH4~5)和盐酸/甘氨酸缓冲液亦用于样品的提取和沉淀蛋白质。其他提取方法包括用含苯丁唑酮离子对试剂的二氯甲烷提取蛋中四环素类药物,超滤法提取牛奶、猪组织中四环素类药物。酸提取法+金属螯合剂2、净化初提取液中含大量的内源性干扰杂质,还需要净化处理,包括液-液萃取、固相萃取(SPE)、基质固相分散、超滤、免疫亲和色谱和在线痕量富集等方法。为达到更好的净化效果,可将几种方法结合使用。（1）液-液萃取：四环素类药物不溶于二氯甲烷等疏水性有机溶剂,因此液-液萃取利用疏水性有机溶剂将水相中的一些脂溶性杂质洗去。但有