8第八章--发酵过程的放大

第八章发酵过程的放大“发酵放大是一门艺术，而不是一门科学”——A.E.Humphrey就目前为止，生化放大过程一直是一个难题。虽然很难用理论分析，但是并不是放大问题没解决就不能放大，反应器的不足可以通过工艺及控制手段来弥补，工艺的欠缺也可以通过改善反应器型式来修正。主要内容一、从摇瓶取得发酵罐放大有用参数的方法及原理二、以摇瓶取得数据为依据进行发酵过程和发酵罐放大三、小型罐到大型罐的放大工业发酵过程的放大第一阶段实验室规模，进行菌种的筛选和培养基的研究第二阶段中试工厂规模，确定菌种培养的最佳操作条件第三阶段工厂大规模生产第一节、从摇瓶取得发酵罐放大有用参数的方法及原理摇瓶培养是在菌种的筛选培养阶段（中试），中试生产的目的是确定菌种培养的最佳操作条件以便于转移到大规模发酵罐进行生产在锥形瓶中装入一定量的培养基，经灭菌后接种，在摇床上恒温振荡培养；在培养过程中分析测定培养液中的有关参数和产物得率。摇瓶试验结果提供了生产菌株的基本信息和发酵工艺数据，经过中试放大后用于工业化生产。但是摇瓶和发酵罐培养之间的差异是不可避免的，其本质原因是由这两种试验规模变化所引起的。摇瓶和发酵罐培养的差异体积传氧系数（KLa）和溶氧的差异CO2浓度的差异菌丝受机械损伤的差异体积传氧系数（KLa）和溶氧的差异通气状况摇瓶培养：空气透过纱布（瓶塞），纱布（瓶塞）对氧传递的阻力、表明通气情况与周围环境有关发酵罐：直接通入空气，鼓泡通气；KLa值溶氧系数在摇瓶和发酵罐中差异很大摇瓶的KLa值装料系数（mL）KLa×107往复式旋转式1017.9211.492015.426.875011.042.961006.511.96往复式：250mL摇瓶，冲程127mm，96次/min;旋转式：250mL摇瓶，偏心距50mm，215rpm发酵罐的KLa值搅拌转速（rpm）四种Vs时KLa值5.62×10-77.04×10-78.79×10-710.55×10-725217.621.92529.232024.227.237.742.238030.867.541.943.5Vs为发酵罐中空气分布器出口的空气线速度(m/s)2.CO2浓度的差异CO2是微生物的代谢产物多数微生物适应低CO2浓度（0.02~0.04%）。当排除的CO2浓度高于4%时，碳水化合物的代谢及呼吸速度下降，影响菌体生长、形态及产物合成摇瓶——常压状态；发酵——正压状态在这两种发酵形式中CO2在发酵液中的溶解度不同（发酵罐内的浓度显著高于摇瓶内的浓度）3.菌丝受机械损伤的差异摇瓶培养：菌体只受液体的冲击或沿着瓶壁滑动影响——机械损伤很轻；发酵罐培养：受搅拌叶的剪切力、搅拌时间的长短等——机械损伤程度远远大于摇瓶培养。搅拌增加菌体受损伤的程度菌体内核酸类物质的漏出率与搅拌转速、搅拌持续时间、搅拌叶的叶尖线速度、培养液单位体积吸收的功率及Kla值成正比关系虽然摇瓶发酵液有少量的核算类物质漏出，其漏出率远低于发酵罐。摇瓶放大培养的结果溶氧敏感，罐中生产能力可能高于摇瓶；机械损伤敏感，罐中的生产能力低于摇瓶；溶氧和机械损伤都敏感，其结果随发酵罐中的特性而定如何从摇瓶发酵获得参数用于发酵罐试验1.增加摇床的转速，提高KLa和溶氧水平2.减少培养基的装液量，注意水分蒸发引起的误差3.直接向摇瓶中通入无菌空气或氧气等措施4.在摇瓶中加入玻璃珠来模拟发酵罐中搅拌，从而研究因搅拌引起的差异5.在摇瓶中附加挡板也可模拟罐发酵时菌丝体的损伤第二节以摇瓶取得数据为依据进行发酵过程和发酵罐放大发酵罐的类型很多，所适用的体系也各异，因此发酵罐的放大是比较复杂的。发酵的放大可以依据一些放大准则好氧发酵中，从摇瓶到中试罐发酵，一般采用以KLa为基准的比拟放大以kLa为基准的比拟放大法有的菌种在深层发酵时耗氧速率很快，因此溶氧速率能否与之平衡就可能成为生产的限制性因素。耗氧速率可以用实验法测定。在小型试验发酵罐里进行发酵过程，用适当的仪器记录发酵液中的溶氧浓度。KLa－－氧传递系数是什么？取样极谱法当电解电压为0.6～1.0V时，扩散电流的大小随液体中溶解氧的浓度成正比变化。KLa,KLa’－－容量传质系数，h-1Patm—大气中氧的分压，PaPflask――摇瓶内氧的分压，Pa；A－摇瓶口截面积，cm2VL’－－培养液体积，mlVL――对应时刻培养液真实体积，mlOUR=PmA(patm-pflask)/VL;OUR’=PmA(pa-pf)/VL’KLa=OUR/(C*flask-CL)；KLa’=OUR/(c*-cL)Pm－－摇瓶口过滤层氧通透率，mmol/(cm2·h·Pa)OUR,OUR’－－培养液中菌体的摄氧率，mmol/(L·h)一、实际发酵情况下摇瓶内KLa的测定二、溶氧和其他因素对发酵的影响通过调节摇瓶装液量或摇床转速来确定溶氧对发酵的影响，并获得最佳的溶氧条件(KLa值）；建立动力学模型μ=μmaxS/(S+Ks)OUR=-μx/Yx/O2pH对发酵的影响cNa+=cNaOHcK+=cK2HPO4+cKH2PO4dcSO42-/dt=D(cSO42-F-cSO42-)+ABtSO42-不同的剪切力对发酵的影响摇瓶中添加玻璃珠数量对菌体浓度和产物得率的影响动力学模型的实验验证一、发酵罐的放大原则（1）几何相似即按小的与大的装置各部分几何尺寸比例大致相同放大。但是，为了避免设备直径过大，大设备的高径比往往大一些。（2）恒定等体积功率放大由Pg/V恒定而确定搅拌转速。（Pg指通气时的搅拌功率）第三节小型罐到大型罐的放大（3）恒定传氧系数kLa放大这个方法抓住了传氧这一关键因素，目前应用很多。具体应用中要注意几个问题。1.小试中要测得准确的kLa值，选择合适的计算公式。2.注意各计算kLa公式在放大中参数的变化及适用范围。3.按照计算P0/Pg选择通气比，计算V求kLa来计算（P0指不通气时的搅拌功率）（4）恒定剪切力恒定叶端速度放大剪切力与搅拌桨叶端速度成正比，在恒定体积功率放大时一般维持n3d2不变（n为搅拌桨转速、d为搅拌桨直径，一般搅拌叶轮直径与罐直径之比为0.33~0.45）（5）恒定的混合时间tM放大（一）以kLa为基准的比拟放大法（二）以Po/V相等为准则的比拟放大（三）其他的比拟放大方法例：某厂试验车间用枯草杆菌在100升罐中进行生产。—淀粉酶试验，获得良好成绩。放大至20立方米罐。以KLa为基准的比拟放大P0——不通气时的搅拌功率Pg——通气时的搅拌功率H－罐身高m；HL－不通气时的液位高m；T－罐直径m；D－涡轮搅拌器直径，m；以Po/V相等为准则的比拟放大对于溶氧速率控制的非牛顿发酵液系统，把Po/V相等作为比拟放大的准则就非常方便，同时也避免了微生物参与所带来的计算kLa的困难。值得注意的是，Po/V与传质系数之间的确存在着重要的关系，但Po/V相等并不意味着kLa相等。二者之间没有必然的联系。流体单位面积上所承受的剪切应力τ,与单元的剪切速率dy/du成正比,称为牛顿粘性定律,服从这一定律的流体称为牛顿型流体.其他的比拟放大方法（一）恒周线速度丝状菌发酵受剪率、特别是搅拌叶轮尖端线速度的影响较为明显。如果仅仅保持kLa相等或Po/V相等，可能会导致严重的失误。在Po/V相等的条件下，D/T比越小，造成的剪率越大，也有利于菌丝团的破碎和气泡的分散，这对于产物抑制的发酵有重要意义。所以，对于这类发酵体系，搅拌涡轮周线速度也被认为是比拟放大的基准之一。其他的比拟放大方法（二）恒混合时间混合时间的定义是把少许具有与搅拌罐内的液体相同物性的液体注入搅拌罐内，两者达到分子水平的均匀混合所需要的时间。混合时间主要与发酵液的粘度有关，通常，低粘度的液体混合时间要少于高粘度的液体。另外，放大罐的体积越大，混合时间就越长。目前，比拟放大虽然必须以理性知识为基础，但也离不开丰富的实际运转经验，特别是对于非牛顿流体发酵系统尤其如此。———发酵过程优化放大研究进展反应液的流变学特性：是指液体在外加剪切力作用下所产生的流变特性，简称流变特性。当给定的流体在外加剪切力的作用下，一定产生相应的剪切速率（即速度梯度或切变率，N/m2或Pa），两者之间的关系为该流体在给定温度和压力下的流变特性：1.流体的流变学特性)(f上式称为流变性方程，其图解形式叫做流变图。生物反应醪液多属与时间无关的粘性流体范围（表5-1）。表5-1与时间无关的纯粘性流体的流变特性类别流变性方程表观粘度a示例牛顿型假塑型(幂律)膨胀型(幂律)平汉塑型凯松塑型恒定不变随剪切率的增加而减少随剪切率的增加而增加气体、水、低分子量液体,低分子化合物的水溶液大多数发酵醪，淀粉悬浮液，纸浆，油漆玉米粉和糖溶液，淀粉，流沙等纸浆，牙膏，油，巧克力及一些发酵液等血，蕃茄酱，桔子汁及一些发酵液等10,nKn1,nKnpK021'210pKa1naK1naKpaK/02210])[(PaK0为屈服应力Pa，Kp为刚性系数Pa·s，K’p为凯松粘度(Pa·s)1/2。有多种经验方程来描述非牛顿流体的流变特性，其中最简单的形式是指数律方程。式中：K——稠密度指数，或称指数律系数Pa·s；n——流变性指数，或称指数律的方次。对于牛顿型流体，n=1，K=。对于非牛顿型流体，将/定名为表观粘度。给定流体的表观粘度是剪切速率的函数。Ʈ=KƔn发酵液流变学特性为菌体的大小和形状的不同所影响一些稀薄的细菌发酵液；以水解糖或糖蜜为原料培养酵母的醪液；为噬菌体侵害的发酵液等均为牛顿流体。丝状菌悬浮液菌呈丝状或团状。丝状菌的菌丝一般有一个以上的分枝，这些菌丝长约50-500m，直径为9～10m。反应器中，这些菌丝体纠缠在一起，使悬浮液粘度达数Pas。团状菌丝体是以稳定的球状积聚在一起而生长，其直径可达几mm。无论是丝状或团状，流变学特性都是非牛顿型流体。2.发酵液的流变学特性表5-2发酵液的流变特性产物微生物发酵液流变特性制霉菌素青霉素青霉素青霉素链霉素新生霉素卡那霉素曲古霉素曲古霉素非洛霉素诺尔斯氏链霉菌产黄青霉菌产黄青霉菌产黄青霉菌灰色链霉菌雪白链霉菌卡那霉素菌卡那霉素链霉菌卡那霉素链霉菌卡那霉素链霉菌牛顿性流体假塑性流体塑性流体胀塑性流体塑性流体塑性流体假塑性流体塑性流体假塑性流体假塑性流体₰丝状菌发酵中，高粘度发酵液的表观粘度明显随剪切速率的不同而变化。₰同一反应器中，离搅拌器远近位置的不同，流动特性明显不同。₰一般丝状菌的发酵液呈假塑性流体、胀塑性流体等非牛顿性流体特性，并且发酵液的流动特性还随时间而变化。₰微小颗粒悬浮液的粘度是多种因素的函数，除依赖菌体颗粒的浓度外，还受颗粒的形状、大小、颗粒的变形度、表面特性等因素影响。霉菌或放线菌等的发酵中，发酵液的流动特性常出现大幅度变化。₰丝状菌发酵中，菌体相互间易形成网状结构，在一定的剪切速率下，团状结构的菌团可被打碎成小片，虽然这些小碎片可再聚集起来，但在高剪切速率下，絮集起来的菌团又将被打碎，使发酵液呈牛顿型流体特性。总之，流体特性因素都会对生化反应器内的质量与热量的传递、混合特性及菌体生长等产生影响。3.计算流体力学（ComputationalFluidDynamics）在发酵过程中的应用数值解与解析解对于科学与工程问题往往需要数学建模，再对方程求解。在解组件特性相关的方程式时，大多数的时候都要去解偏微分或积分式，才能求得其正确的解。依照求解方法的不同，可以分成以下两类：解析解和数值解。数值解(numericalsolution)是采用某种数值方法，如有限元的方法,数值逼近,插值的方法,得到的解。只能利用数值计算的结果,而不能得到自变量和应变量的函数关系，而求出任意给定自变量的应变量的值。当无法藉由微积分技巧求得解析解时，这时便只能利用数值分析的方式来求得其数值解了解析解(analyticalsolution)就