第8章-紫外可见吸光光度法及分子荧光分析法

1第8章紫外-可见吸光光度法及分子荧光分析法8.1吸光光度法的基本原理8.2光度分析的方法和仪器8.3吸光光度法的灵敏度与准确度8.4显色反应与分析条件的选择8.5吸光光度法的应用8.6紫外-可见分光光度法在有机定性分析中的应用8.7分子荧光与分子磷光分析法2化学分析：常量组分(1%),Er:0.1%～0.2%依据化学反应,使用玻璃仪器化学分析与仪器分析方法比较仪器分析：微量组分(1%),Er:1%～5%依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器例:含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则m(Fe)≈0.1mg重量法m(Fe2O3)≈0.14mg,称不准容量法V(K2Cr2O7)≈0.02mL,测不准光度法结果0.048%～0.052%,满足要求准确度高灵敏度高3仪器分析方法分类非光谱法（折射法，浊度法，旋光法）（不以光的波长为特征讯号）光谱法分子光谱法UV/Vis,IR,MFS,MPS原子光谱法AAS,AES,AFS（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）光学分析法2.电化学分析法:依据物质的电化学性质及其变化3.色谱法:气相色谱,液相色谱4.质谱法、热分析法、放射化学法等1.光学分析法:基于电磁辐射与物质的相互作用.4分子光谱学紫外-可见分光光度法(UV/Vis)UltraViolet/VisibleSpectrophotometry红外吸收光谱法(IR)InfraredSpectroscopy分子荧光光谱法(MFS)MolecularFluorescenceSpectroscopy5光声光谱法(PAS)PhotoAcousticSpectroscopy拉曼光谱法(RS)RamanSpectroscopy核磁共振波谱法(NMR)NuclearMagneticResonanceSpectroscopy质谱法(MS)MassSpectroscopy发展联用技术是趋势!分子磷光光谱法(MPS)MolecularPhosphorescenceSpectroscopy68.1吸光光度法的基本原理特点–灵敏度高：测定下限可达10-5～10-6mol·L-1,10-4%～10-5%–准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2%～5％（1%～2％）–操作简便快速–应用广泛吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法.7I0It光强的测量—分光光度计分光光度法的应用：定量测定与定性分析物质对光有选择性吸收—准备知识光强的减弱与物质浓度的关系？—朗伯-比尔定律测量光强度的减弱88.1.1光的基本性质电磁波的波粒二象性c－真空中光速2.99792458×108m/s~3.0×108m/sλ－波长，单位：m,cm,mm,m,nm,Å1m=10-6m,1nm=10-9m,1Å=10-10mν－频率，单位：赫兹(周)Hz次/秒n－折射率，真空中为1==cVn光的传播速度:波动性9XYZx电场向量10h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J·s－频率E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)1eV=1.602×10－19J微粒性光量子，具有能量.Eh11结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低.单色光：具有相同能量(相同波长)的光.混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起.例如白光.===cVEhhhn波粒二象性真空中:cEh12电磁波谱及分析方法电磁波长(cm)10-8~10-1310-6~10-910-4~10-610-410-1~10-410-1~10-2102Å10-5~10.1~100100~104104104~107nm10~400400~780780~3×105名称γ射线X射线紫外线可见光红外线短波中波能量(eV)104~109102~1051~102110-3~110-6~10-3~10-6能级跃迁原子核内层电子外层价电子分子轨道电子分子转动或振动未成对电子的偶极矩原子核的偶极矩利用吸收的分析方法γ射线吸收法X射线吸收法原子吸收法紫外吸收法可见光分光光度法红外吸收分析顺磁共振核磁共振利用发射的分析方法活化分析X射线荧光发射X射线原子荧光分析火焰光度分析发射光谱分析荧光分析磷光分析拉曼分析利用相互作用的分析方法电子射线分析X射线衍射分析比浊法旋光光谱法圆偏光二向性法13光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780nm~2.5µm2.5µm~50µm50µm~300µm148.1.2物质对光的吸收与发射1.电子相对于原子核的运动--电子能级;单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反.三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同.2.原子核在其平衡位置附近的相对振动--振动能级;3.分子本身绕其重心的转动--转动能级.物质分子内部3种运动形式及其对应能级：15S2分子吸光与发光示意图Ee振动能级v3v2v1转动r3r2r1S1S0紫外荧光磷光T2T1可见EvEr红外单重态三重态16光谱种类原子光谱：吸收、发射、荧光线状光谱黑体辐射：白炽灯、液、固灼热发光连续光谱分子光谱：紫外、可见、红外等吸收光谱带状光谱I17/nm颜色互补光400～450紫黄绿450～480蓝黄480～490绿蓝橙490～500蓝绿红500～560绿红紫560～580黄绿紫580～610黄蓝610～650橙绿蓝650～760红分子对光的吸收与吸收光谱不同颜色的可见光波长及其互补光蓝绿18熔融石英晶体石英玻璃NaCl170nm~3.6µm200~600nm2µm~3.5µm360nm~2.5µm200nm~15µmKClKBrCsI200nm~18µm230nm~25µm230nm~50µm一些材料的有效透明区19Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱300400500600700/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance35020苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱苯(254nm)甲苯(262nm)A/nm23025027021不同物质吸收光谱的形状以及max不同——定性分析的基础同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax不同——定量分析的基础228.1.3光吸收基本定律:朗伯-比尔定律朗伯定律:(1760)A=lg(I0/It)=k1b当入射光的,吸光物质的c一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c当入射光的,液层厚度b一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.23朗伯-比尔定律意义:当一束平行单色光通过均匀、非散射的溶液时，其吸光度与溶液中吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.A=lg(I0/It)=kbc24透光率(透射比）T（Transmittance）t0=ITIA=lg(I0/It)=lg(1/T)=—lgT=kbc吸光度A(Absorbance）--=10=10kbcATI0It入射光透过光25吸光度A、透射比T与浓度c的关系AT/%cA=kbc1.00.80.60.40.2-kbcT=101008060402026k吸光系数Absorptivitya的单位:L·g-1·cm-1当c的单位用g·L-1表示时，用a表示，A＝abc的单位:L·mol-1·cm-1当c的单位用mol·L-1表示时，用表示.－摩尔吸光系数MolarAbsorptivityA＝bc1%1cmE当c的单位用g·100mL-1表示时，用表示,A＝bc，叫做比吸光系数.1%1cmE1%1cmE27吸光度与光程的关系A=abc0.10b0.202b0.00光源检测器显示器参比28吸光度与浓度的关系A=abc0.10c0.202c0.00光源检测器显示器参比29吸光度与波长的关系A=abc0.00红0.10红0.00光源检测器显示器参比蓝绿光红光30朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光应选用max处或肩峰处测定.2.吸光质点形式不变离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件(酸度、浓度、介质等).3.稀溶液浓度增大，分子之间作用增强.31溶液浓度的测定A＝bc工作曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的分析应用Ax01.02.03.04.0c(mg·mL-1)A*0.800.600.400.200.00cx328.1.4吸光度的加和性与吸光度的测量A=A1+A2+…+An用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等.001221=lg=lg=-=lgIIIAAAAAIII参参比液比试试液338.2光度分析的方法和仪器方便、灵敏，但准确度差.常用于限界分析.8.2.1光度分析的几种方法1.目视比色法观察方向c1c2c3c4342.光电比色法光电比色计结构示意图通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)35滤光片吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光通过，其他波长的光均被吸收.选择滤光片的原则：滤光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光,即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补.363.吸光光度法和分光光度计光源单色器吸收池检测系统分光光度计的基本组成通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.37分光光度计的主要部件光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)氙灯：紫外、可见光区均可用作光源/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯（气体放电光源）氢灯强度38氙灯氢灯钨灯39棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同.单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光λ1λ280060050040040在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600，1200，2400条/mm)利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便.－平面透射光栅－反射光栅（广泛使用）法线dirEchellette型光栅的衍射机理光栅41吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液.可见光区：光学玻璃池紫外区：石英池检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号.光电池，光电管，光电倍增管检流计(指示器)：低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录42硒光电池（Barrier-layerphotocell）适用于300~800nm,在500~600nm范围最灵敏.Se阴极Au，Ag半导体h阳极43光电管(Phototube)h（片）红敏管625~1000nm蓝敏管200~625nm44光电倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)1个光子可产生106～107个电子160~700nm45722型分光光度计光源：钨卤素灯－12V、30W波长范围：330～800nm分光元件：光栅，1200线/mm检测器：端窗式G1030光电管多碱阴极真空管300～850nm波长精度：2nm光谱带宽：6nm波长精度：仪器波长指示器所显示的波长值与仪器对应输出的实际波长值之间的符合程度。可用二者之差来衡量.46吸光光度法仪器主要差异比较可见光(380～780nm)紫外（200～380nm)中红外（2.5～50µm)光源钨灯碘钨灯320～2500氢灯氘灯180～375硅碳棒（红外线）吸收池材料玻璃350～3200石英185～4000NaCl晶体471.单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图8.2.2分光光度计的基本类型482.双光束分光光度计参比池检测器滤光片或单色器放大器样品池光源hv光子检测器反光镜反光镜透明部分扇形镜正面图扇形镜反光镜栅镜双光束型可以消除光源强度变化的影响.4