第五章茎尖培养与快速繁殖

第五章茎尖培养与快速繁殖第一节茎尖培养脱毒技术一、培育无病毒苗的意义植物病毒病：由病毒和类病毒、支原体等引起，已发现此类病害700多种，无性繁殖植物严重；无特效药，培育无毒种苗是主要防治措施。获得无病毒种苗的途径：1）从现有种质中筛选无毒单株；2）已感染植株脱毒。二、植物脱毒的方法1.热处理：病原物与植物耐热性不同，将植物在较高温度下处理一段时间，病原物钝化、失活或不能繁殖，而植物所受影响较小、生长较快，使病毒减少甚至消灭。方法：1)温汤浸渍：50℃温水中浸10分钟~数小时，简便易行，适用于休眠器官、接穗或种子。2)热空气处理：在温热治疗室/箱内，35~40℃，几十分钟~数月。对茎尖效果较好，热处理后取较大茎尖培养，可提高成活率与脱毒率。注意：易受伤，掌握温度与时间。2.茎尖培养脱毒3.其他途径脱毒3.1愈伤组织培养脱毒：花器官、珠心胚等愈伤中存在无病毒细胞群，从再生植株可得到无病毒苗。3.2茎尖微体嫁接脱毒：在无菌条件下，将切取的茎尖嫁接到培养的砧(zhen)木苗上。3.3抗病毒剂的应用：抗病毒醚:可抑制病毒复制和扩散，嘌呤和嘧啶类似物;抗菌素三、茎尖培养脱毒技术1、原理病毒在植物体内分布不均匀，茎尖等生长点因为无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以茎尖几乎不含病毒。茎尖培养脱毒效果好，后代稳定，目前广泛应用。2、脱毒技术2.1操作取无菌顶稍1~2cm→解剖镜(8—40倍)下→剥去幼叶→切取茎尖0.2～0.5mm、带1~2个叶原基→接种。注意：随切随接，防止变干；茎尖小较好，但太小不易成活，过大又不能保证完全脱毒。草莓：茎尖0.2~0.3mm，脱毒率100%；1mm，脱毒率50%。2.2培养基基本培养基:MS、White、B5等。碳源:蔗糖效果好，可用白砂糖激素：2,4-D、IAA、NAA等，通常低浓度。2.3继代培养初代培养长成的新梢→切成小段→增殖培养基→1个月左右→新梢又可扩繁→→建立和维持茎尖无性系。继代培养常用MS培养基。2.4生根与移栽常用生根方法：用1/2、1/3、1/4MS或White培养基，附加NAA、IAA、IBA等，最好加活性炭(0.3％)。或者：将新梢基部浸入50~100mg/L的IBA中4-8h，然后转入无激素培养基中生根。移栽：同前。3、脱毒苗的鉴定3.1酶联免疫法（ELISA）将抗原和抗体的免疫反应与酶的高效催化作用相结合，形成酶标记的免疫复合物；酶遇到底物后生色，用肉眼观察，或用比色法检测结果。灵敏度高，广泛应用。3.2抗血清鉴定法用已知抗血清鉴定未知病毒的种类。3.3指示植物法指示植物：对某种或某几种病毒/类病毒具有敏感反应，并表现明显症状的寄主植物，又称鉴别寄主。两类指示植物：一是产生系统性症状，病毒可扩展到非接种部位，常无局部病斑；二是只产生局部坏死、褪绿或环状斑。方法：将脱毒苗汁液接种在指示植物上，根据病斑产生与否鉴别脱毒情况。只能鉴定靠汁液传染的病毒，草本接种较易，木本较难，用嫁接传染法。3.4分子生物学检测1）dsRNA分析2）核酸分子杂交。3）PCR技术。3.5电镜检查4、脱毒苗的保存与利用4.1脱毒苗的保存脱毒植株可能很快被重新感染，应隔离繁殖与保存。原原种：经脱毒处理、检测无毒的植株；原种：由原原种在隔离条件下繁殖的种苗；由原种繁殖的脱毒苗供生产用。隔离措施：建立隔离带、防虫网室，土壤消毒。4.2脱毒苗的利用尽量用染毒轻的生产场地，一旦感染，应重新采用无病毒苗。脱毒苗的繁育体系流程工作区域第一年脱毒试管苗无菌室第二年原原种无菌室第三年原种网室/温室第四年良种隔离区第五年商品种繁殖区生产生产大田5.中国组培脱毒苗生产现状已建立马铃薯（病毒病减产50%以上）、草莓、甘薯、苹果、葡萄、香蕉、菠萝、番木瓜、甘蔗等脱毒苗生产基地。脱毒苗通常增产20~30%，草莓可达50%，且上等果比例高。第二节茎段培养快速繁殖技术一、离体快繁的应用1、概念：将植物的器官和组织进行离体培养，使其快速成苗的技术，又叫微繁殖。应用：珍稀濒危植物名优特新品种脱毒苗转基因试管苗的快繁。林木、园艺、药用植物广泛应用，重点在无性繁殖植物。2、优缺点优点：1）繁殖系数高、速度快：扦插和嫁接每年几倍~几十倍；离体快繁几万~百万倍。2）繁殖特殊材料：单倍体、三倍体，常规方法繁殖难。3）可与脱毒技术相结合。4）生长一致，商品性好，可常年进行。缺点：操作复杂，设备昂贵，成本较高。二、离体快繁技术1.无菌培养物的建立常用带芽的茎段、茎尖或芽，某些植物用根、茎、叶或花器官等作外植体，接种培养，获得初代培养物。2.茎芽的增殖以芽的增殖为主，可以不考虑根的生长。依外植体不同，初代培养获得茎芽有4种途径：1）顶芽/腋芽增殖：用茎尖或侧芽培养获得丛芽或芽苗，可加细胞分裂素促进之。草莓、香石竹、唐菖蒲、非洲菊、月季、苹果、葡萄、猕猴桃等。此途径较普遍。2）不定芽增殖：在根、茎、叶、愈伤等非芽固定生长位置产生的芽都叫不定芽。此途径较普遍。由愈伤再生不定芽一般不可取（耗时、变异）。3）体胚增殖：有200多种植物可产生体胚，前景好，但目前很多物种还不成熟，成苗率低。4）原球茎增殖：兰科植物茎尖或侧芽培养形成球形块茎，一种特殊的繁殖体，本身可以增殖，转移到生根培养基上后长成小植株。以兰花为例：兰花离体快繁：Morel提出了兰花离体无性繁殖方法。兰茎尖→原球茎→芽→根（兰苗）原球茎:类似于种子萌发时由胚形成的结构；将原球茎分割成小块后可快速产生新的原球茎，并可成苗。3.壮苗、生根与移栽组培苗/嫩枝1~2cm高时进行。先壮苗后生根，即降低细胞分裂素浓度，增强光照等。问题：不易生根（延长时间、继代）；生根：1/2或1/4MS，减少或去掉细胞分裂素，加适量NAA或IBA（吲哚丁酸）；减少蔗糖，增强光照。移栽：同前。4、存在问题1）外植体褐变原因：主要是外植体中的多酚氧化酶被激活，催化酚类生成醌类，醌经非酶促聚合，形成深色物质。危害：毒害细胞，影响外植体生长与分化，甚至死亡。影响因素：基因型、生理状态、外植体受伤程度、灭菌时间、培养基和培养条件。减轻褐变的措施：a.外植体：选酚类含量低的基因型及幼龄材料剪取外植体→液体预培养3~7d→取出用漂白粉等还原剂浸泡→正式接种培养。b.培养基与培养条件：用低盐培养基，减少细胞分裂素，适当低温、弱光照，连续继代培养。c.用褐变抑制剂和吸附剂：培养基中加Vc、聚乙烯吡硌烷酮（PVP，酚类专一吸附剂）、活性炭、半胱氨酸、柠檬酸、谷胱甘肽[glu:tə'θaiəun]等抗氧化剂，或用SO2、亚硫酸盐、氯化钠等PPO(多酚氧化酶)抑制剂。几种试剂混用效果可能更好。2）组培苗玻璃化症状：茎叶半透明或透明、水渍状，叶皱缩卷曲，植株矮小、失绿、含水多、脆弱易碎。原因：不清楚，基因型、培养基、细胞分裂素较高及弱光照、高温高湿、透气性差、继代次数过多等都有影响。降低玻璃化的措施：a.增加琼脂或蔗糖，或加渗透剂，以提高培养基渗透压，使组培苗吸水困难；b.降低细胞分裂素用量，加适量IAA、GA3、ABA；c.减少NH4+、提高Ga2+含量；d.增加/进行自然光照（UV促进木质化和试管苗成熟）；e.降低培养温度，或变温培养；f.用通气性好的封口材料。3）生根难：对策：a.降低培养基盐浓度；b.适当增加IAA等生长素用量，不用或少用细胞分裂素；c.减少糖供应、增加光照以增强植株的自养能力；d.较难生根的木本植物采取微体嫁接、化学刺激等方法处理。