微生物学实验指导书

微生物学实验指导书生物技术教学部初立业编重庆邮电学院生物信息学院2003年12月30日1前言一、本课程的性质和任务微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。二、教学要求与教学方法1.教学要求1)注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向；2)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤；3)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象；4)树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密配合。2.教学方法1)以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示；2)对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有机结合；3）根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思；4）严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。三.教学学时分配与安排本课程按每周3学时安排，共6个实验，总学时18。2目录实验一细菌的革兰氏染色………………………………………3实验二根霉、酵母菌形态结构的观察…………………………4实验三培养基制备………………………………………………6实验四灭菌与消毒………………………………………………9实验五微生物的分离和纯化……………………………………12实验六微生物的生理生化反应…………………………………14实验七水中细菌总数的测定……………………………………19实验八放线菌形态的观察………………………………………21实验九细菌的芽胞染色…………………………………………22实验十微生物菌种保藏…………………………………………243实验一细菌的革兰氏染色法实验目的：1．学习并初步掌握革兰氏染色法。2．了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。实验原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。实验器材：1．菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)约24h营养琼脂斜面培养物，蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）12～20h营养琼脂斜面培养物。2．染色剂革兰氏染色液。3.仪器或其它用具显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水。实验内容：1．制片取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。*要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。2．初染4滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。3．媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。4．脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。*革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。5．复染用番红染液复染约2min，水洗。6．镜检干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。7．混合涂片染色按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作为混合涂片、染色、镜检进行比较。实验报告：1．列表简述3株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。2．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？最关键的环节是什么？3．现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。4．你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。5．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？6．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？7．你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？实验二根霉、酵母菌形态结构的观察实验目的：1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。2．学习并掌握观察霉菌的基本方法，了解四类常见霉菌的基本形态特征。实验原理：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水侵片来观察酵母菌的形态和发芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进5行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。霉菌可产生分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，可用低倍显微镜观察。观察霉菌的形态主要有三种方法，直接制片观察法：是将培养物放置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检，其制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保存较长时间；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差。必要时，还可用树脂封固，制成永久标本长期保存。载玻片培养观察法：用无菌操作将培养物琼脂薄层放置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这中方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育时期的培养物。玻璃纸培养观察法：霉菌的玻璃纸培养观察方法与放线菌玻璃纸培养观察方法相似。这种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，也可获得良好的效果。实验器材：1.菌种酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培养约2day的麦芽汁斜面培养物，曲霉(Aspergillussp.)，青霉(Pencilliumsp.)，根霉（Rhizopussp.）和毛霉（Mucorsp.）培养2-5天的马铃薯琼脂平板培养物。2.溶液或试剂0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液，乳酸石炭酸棉蓝染色液。3.仪器或其它用具显微镜，载玻片，盖玻片，无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，U型玻璃棒，解剖针，镊子，50%乙醇，20%的甘油等。实验内容：（一）酵母观察1.美蓝浸片的观察(1)在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌放在染液中，混合均匀。(2)用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢地将盖玻片放下使其盖在菌液上。(3)将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。(4)染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。(5)用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。2.水—碘液浸片的观察在载玻片中央加一小滴革兰氏染色液用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水—碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。（二）霉菌观察1.直接制片观察法6在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染色液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，放置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。2.载玻片培养观察法(1)培养小室的灭菌在平皿皿底铺一张略少于皿底的圆滤纸片，再放一U型玻璃棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖。包扎后121°C灭菌30min，烘干备用。(2)琼脂块的制作取已经灭菌的马铃薯琼脂培养基6~7ml注入另一个灭菌平皿中，使之凝固成薄层。解剖刀切成0.5~1cm2的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上。(3)接种用尖细的接种针挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖再琼脂块上。(4)培养先在平皿的滤纸上加3~5ml灭菌的20%甘油(用于保持平皿内的湿度)，盖上盖，28°C培养。(5)镜检根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。实验报告：1．绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征2．说明观察到的吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？分析其原因。3．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？4．你主要根据哪些形态特征来区分所观察的四种霉菌？5．在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？实验三培养基制备实验目的：了解培养基的制备原理并掌握其制备过程。实验原理：培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。由于各种微生物所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。可以根据微生物种类和实验目的不同分成若干类型。培养基的类别如下：1.按照培养基的成分来分培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。(1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏培养基等。(2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。(3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基7的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯