生物样品制备

生物样品制备一生物样品采集及细胞破碎生物样品指：植物的花、茎、叶、根、种子动物的体液：尿、血、唾液、胆汁、胃液、淋巴液、其他分泌液毛发、肌肉、组织器官；各种微生物。1生物样品采集1.1采样工具生物样品采集与自然界中其他样品采集不同，可以用：注射器吸取手术刀、剪切割1.2注意事项•采样要有代表性(体液：几μL，器官组织：几mg);•采样时机；•采样部位准确；•采样后应立即加以处理，如采好血样后立即加抗血凝剂，组织器官加防腐剂，动物样品速冻处理，植物样品脱水处理。•采用工具需消毒，最好经过无毒处理。2细胞破碎2.1目的破坏细胞外壳，使细胞内含物有效地释放出来。即：将生物体细胞内及多细胞生物组织中的待测组分(如激素、酶、基因工程产物等)充分释放到溶液中。不同的生物体同一生物体的不同组织不同细胞破碎方法比较柔软的组织（胰脏、肝脏、脑组织）：普通匀浆器研磨植物肉组织：一般研磨含纤维多的植物组织：组织捣碎器捣碎或加砂研磨具有坚韧细胞壁的微生物：自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波或加压处理。2.2实验室中常用细胞破碎方法细胞破裂机械法非机械法液体剪切固体剪切脱水溶胞作用超声波机械搅研磨压力拌压力杆、臼Hughes球磨机压榨机X压榨机物理的化学的酶的溶菌空气干燥真空干燥冷冻干燥溶剂干燥渗透冲击阳离子和酶和有压力释放阴离子关的酶冻结洗涤剂噬菌体和融化抗生素溶胞甘氨酸抗菌素(1)机械法原理：通过机械切力的作用使组织细胞破碎。高速组织捣碎机：动物组织内脏、植物肉质种子、柔嫩的叶、菜籽材料破碎。样品配成稀糊状液，装1/3体积玻璃匀浆器：细胞破碎程度比高速组织捣碎机高,机械切力对生物大分子破坏少。研磨：细菌和植物材料，加玻璃砂效果更好。(2)物理法原理：通过各种物理作用使组织细胞破碎。反复冻融法：适于大部分动物细胞及细胞内的颗粒破碎。方法：待破碎样品冷至－15－－20℃使之冻固，然后缓慢融化。冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸。方法：材料在90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使迅速冷却，以破坏绝大多数细胞。超声波处理法：多用于微生物材料处理效果与样品浓度和使用频率有关注意避免溶液中沉淀存在对超声波敏感的核酸和酶慎用加压破碎法：加水压或气压，当压力达到20－35MPa时，90％以上的细胞被压碎。(3)化学及生物化学法原理：通过化学试剂或酶破坏细胞壁使细胞破碎。自溶法：新鲜生物样品在一定的pH和温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。动物样品一般0－4℃；微生物：室温。加入甲苯、氯仿可以防止外界细菌污染。酶处理：溶菌酶可以专一性地破坏细菌细胞壁；蜗牛酶也可以破坏细菌细胞；纤维素酶常用于破坏植物细胞。表面活性剂处理法：常用的有：十二烷基磺酸钠氯化十二烷基吡啶去氧胆酸钠其他方法：改变细胞膜透性、破坏蛋白质与脂类结合等。如真空干燥、制成丙酮粉。注意：•无论用哪一种方法破碎细胞，都需要在一定的稀盐溶液或缓冲溶液中进行；•一般还需加入保护剂防止生物大分子变性和降解。二生物大分子的提取与蛋白质的去除1、生物大分子的提取1.1生物大分子是指在分子量在数千到数百万的大分子。主要包括多肽、蛋白质、酶、核酸、多糖等，在细胞破碎时被充分释放出来。为了将它们制备成色谱分析的样品需要用一定的溶剂将它们抽提出来，与细胞残渣分离。生物大分子大部分可溶于水或含有少量酸、碱、盐的水溶液。有时也加入一些有机溶剂改善欲测组分的提取效率，并使欲测组分与其他组分分离，以便于色谱分析。1.2生物大分子提取条件影响提取的因素较多，要根据经验，结合具体实验条件，选择最佳条件和方法，达到提取的最佳效果。影响生物大分子提取的主要因素：•溶剂性质•pH值•离子强度•介电常数•提取温度等。(1)溶剂的选择常用水以及稀盐、稀碱、稀酸溶液，有的用不同比例的有机溶剂，如乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳等;一些与脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，常用丁醇提取效果较好(丁醇亲脂性强，兼亲水性，可取代蛋白质结合的脂质位置，还可阻止脂质重新与蛋白质分子结合，使蛋白质在水中的溶解能力增加);选择溶剂时注意:极性物质易溶于极性溶剂；非极性物质易溶于非极性有机溶剂中；碱性物质易溶于酸性溶剂；酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高时溶解度相应增大；远离等电点时溶解度增加。(2)pH值pH值的选择与溶解度、稳定性有很大关系。一般在稳定的范围内，选择在偏离pI的两侧。如细胞色素C和溶菌酶都属碱性蛋白质，常用稀酸提取。提取时，某些蛋白质或酶与其他物质结合，常以离子键形式存在，选择pH=3~6范围，对分离离子键有利注意测量pH值的准确性，误差不应超过±0.1。（3）温度一般提取温度在5℃以下，但对温度耐受力较高的欲测组分，可适当提高提取温度，使得某些杂蛋白质变性分离，有利于提取和下一步的色谱分析。如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶以及许多多肽激素，选择在37~50℃下提取，效果比低温提取更好。2蛋白质的去除蛋白质的存在常常干扰生物样品中的一些小分子化合物及一些多肽类化合物的分析，需要在制备色谱分析样品时将这些蛋白质除去。常用的除蛋白质方法有：•加热法•盐析法•有机溶剂沉淀法•等电点沉淀法•膜分离法•凝胶层析（1）加热法当欲测组分热稳定性好时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀；加热温度视欲测组分的热稳定性而定，通常可加热到90℃。蛋白沉淀后可用离心或过滤除去；加热法最简单，但只能除去热变性蛋白。(2)盐析法原理：利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同程度的降低来沉淀除去蛋白质。在低盐浓度下，蛋白质溶解度随着盐浓度升高而增加－－盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同蛋白质溶解度又以不同程度下降，并先后析出沉淀－－盐析作用。（这是蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团的静电引力造成的。由于水中加入少量盐，增加了溶液的极性，减弱了蛋白质分子间的作用力，促使其溶解度增大。当盐浓度增加到一定程度时，水活度被降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子又相互聚集而沉淀析出。）盐析法的优点：对设备和条件要求低，安全，应用范围广泛；一般可在室温下操作；常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。硫酸铵的盐析能力强，饱和液浓度大，溶解度受温度影响小，一般不会使蛋白质变性。但缓冲能力差，pH值常在4.5～5.5间。盐析注意事项①盐的饱和度影响盐的饱和度是影响蛋白质盐析懂得重要因素，不同的蛋白质盐析所要求的饱和度不同。②pH值的选择蛋白质在等电点（pI）时的溶解度最小，最易从溶液中沉淀析出，因此进行盐析时的pH值应选择在被沉淀蛋白质的pI附近。③蛋白质浓度的影响在相同盐析的条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀。④温度的影响一般可在室温下进行。（3）有机溶剂沉淀法蛋白质的沉淀与溶解，与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数，能增加蛋白质分子上不同电荷的引力，使其溶解度变小，同时还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。乙醇和丙酮是最常用的有机溶剂，丙酮的介电常数小于乙醇，故沉淀的能力较强。常用的蛋白质沉淀剂的蛋白质沉淀效率沉淀剂上清液pH沉淀0.5ml血浆中95%以上蛋白时所需沉淀剂体积/ml三氯醋酸（0.1g/ml）1.4～2.00.2高氯酸（0.06g/ml）1.50.2钨酸2.2～3.90.6焦磷酸（0.05g/ml）1.6～2.70.4硫酸铜－钨酸钠5.7～7.31.0氢氧化锌6.5～7.51.5硫酸铵7.0～7.72.0乙腈8.5～9.51.0丙酮9～101.0乙醇9～101.5甲醇8.5～9.51.5(4)等电点沉淀法利用蛋白质在等电点时溶解度最低，用酸、碱调pH，可使蛋白沉淀析出，但等电点沉淀法沉淀不完全，可与有机溶剂沉淀法，盐析法联合使用。(5)膜分离法膜分离技术可将欲测小分子化合物和大分子的蛋白质很好分离。包括:超滤反渗透析电渗析微孔过滤气体渗析超精密过滤等。超滤是一种除去样品中蛋白质和其他大分子的方法，利用分子分离的薄膜分离技术，依靠薄膜两侧压力差作为推动力来分离溶液中不同分子量的物质。超滤膜的制作材料有醋酸纤维素、聚酰胺、聚砜等，其中醋酸纤维素最常用。与沉淀法相比，超滤的优点在于适用于小量样品，不用稀释样品也不用改变样品的pH值，尤其适用于对酸碱不稳定的化合物特别是欲测组分易被某种酶分解时用超滤可除去该酶，避免欲测物分解。但超滤可能会由于欲测组分结合在膜上面影响回收率。（6）凝胶层析利用分子大小不同的物质在流过凝胶固定相的保留时间不同，大分子首先流出，小分子最后流出，可将欲测小分子化合物与大分子蛋白质分离。由于欲测小分子化合物的浓度被流动相所稀释，必要时还要进行浓缩后再用色谱分析。（（7）柱层析用能吸附蛋白质的材料装填成小柱，使欲测蛋白质的样品流过小柱，样品中的蛋白质被柱填料吸附，欲测组分不被吸附，从小柱中流出。这种小柱称为预柱。预柱可以直接连在HPLC的进样装置上，含蛋白质的样品通过预柱后可直接HPLC系统分析。如分析尿中的某些代谢产物时，可将样品通过预柱，除去蛋白质，直接进入HPLC分析。(8)高速离心•原理：高速离心是根据物质沉降系数、质量、浮力因子等不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法，是生物样品制备中常用的分离方法之一。•在高速离心时蛋白质等生物大分子将首先沉淀在离心管底部，不同分子量的蛋白质等生物大分子沉降速度不同，也可按分子量大小沉降在离心管的不同位置，这样就可以从离心管的不同位置取出样品进行色谱分析。注意：在选择蛋白质的方法时要考虑欲测小分子化合物的性质，所需除去的蛋白质的性质及色谱分析时使用何种色谱技术；最好是使用加热法、有机溶剂沉淀法、膜分离方法和柱层析法。（不会引入新的干扰化合物，而盐析法将引入高浓度的盐，当这些盐对下一步色谱分析不干扰时可考虑盐析法，否则在除去了蛋白质后还要消除盐的干扰。）三微透析技术微透析(microdialysis)技术起源于２０世纪６０年代，目前微透析技术在用色谱分析，特别是用毛细管电泳分析生物样品时得到了广泛的推广和应用。微透析技术实质上是一种膜分离技术，是一种利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的新型采样和色谱样品制备技术。微透析探针很细，可以在不破坏生物体内环境的情况下，直接插到生物活体需采样的部位进行采样，并不影响生物体的生命，所以微透析技术可以用来研究生物体在活动时体液组成的一些变化。3.1原理•微透析是一种在不破坏（或破坏很少）生物体内环境的前提下，对生物体细胞液的内源性或外源性物质进行连续取样和分析。将由膜制成的微透析探针植于需要取样的部位用与细胞间液非常接近的生理溶液以慢速度（0.5～5μL/min）灌注探针由于膜内外欲测组分的浓度差而使得膜外的体内欲测组分进入膜内，并被灌注液带到体外，进入仪器，如毛细管电泳，微柱HPLC等等，进行分析。控制取样条件恒定，灌注液的组成和流速恒定，则微透析的回收率保持一定。微透析探针由膜，导管及套管等部分组成，探针的长度一般在0.5～10mm，膜材料常用纤维素膜、聚丙稀腈膜和聚碳酸脂膜，这些膜完全不具有化学选择性，小分子进出膜完全由膜孔大小所决定。3.2回收率校正微透析技术在定量分析中最重要的工作是确定透析探针的回收率，这也是利用微透析技术进行定量分析的理论基础。定义:流出灌注液中欲测组分的浓度（Ｃd）与探针膜外细胞间液中欲测组分的浓度（Ｃo）之比称为微透析回收率。%100CoCdR影响透析探针的回收率的因素：膜的长度膜的几何形状灌注液流速欲测组分的性质取样时的温度透析的过程实质上是一个浓度扩散过程，当透析探针刚刚植入体内细胞间液时，欲测组分对膜内外而言，是一非平衡状态。由于欲测组分不断透过膜，由膜外进入膜内，使得Cd在不断增加。当Cd增加到某一值时，即透析探针植入一定时间后，透析过程达到平衡，Cd也不再继续增加，达到一恒定值。这时透析探针的回收率保持一常数。体内校正回收率的方法(1)内标法:在