烟草黑胫病菌0号小种不同条件下培养特性的研究

烟草黑胫病菌0号小种不同条件下培养特性的研究苏振刚王静周佳等(1.中国农业科学院烟草研究所，青岛266101；2.中国农业科学院研究生院，北京100081)摘要：研究了烟草黑胫病菌0号小种的若干培养性状，为进一步展开与之相关的研究和综合防治提供试验依据。本实验用培养基、光照、菌龄、诱导剂和诱导时间等不同因素来研究烟草黑胫病菌0号小种的生长速度、产孢量和游动孢子释放量等培养特性。结果表明：将0.1%KNO3和1%葡萄糖混合液加入在燕麦培养基上避光培养21d的培养皿中，经26℃恒温培养72h后，突降12℃培养0.5h，最易产生孢子囊和释放游动孢子。关键词：烟草；黑胫病菌；培养特性；不同因素中图分类号：S435.72StudyontheCulturalCharacteristicsUnderDifferentConditionsofPhytophthoraNicotianaevar.nicotianae,PathogenofTobaccoBlankShankNo.0SuZhengangWangJingZhouJia(1.TobaccoResearchInstituteofCAAS,Qingdao266101,China;2.GraduateSchoolofCAAS,Beijing100081,China)Abstract:ThestudywasconductedtoobserveculturalcharacteristicsofPhytophthoranicotianaevar.nicotianae,pathogenicoftobaccoblankshankNo.0,werestudiedtoprovidemoreinformationforrelationstudyandintegratedmanagementofthedisease.Thestudyusesexperimentalmedium,light,bacteriaage,inducingagentsandinductiontimetoobserveculturalcharacteristicsofPhytophthoranicotianaeBredadeHaanvar.nicotianaeNo.0,suchasthegrowthrateoftobacco,sporangiumproductionandtourdynamicsporesreleaseect.Theresultsshowedthat:The0.1%KNO3and1%glucosesolutionareaddedtocultured21doatsculturemediumdishinthedarkby26℃constanttemperature,after72hculture,dump12℃,0.5h,mostlikelytoproducesporangiaandreleaseoftourdynamicspore.Keywords:Tobacco;Phtophthoraparasitica;Culturecharacteristics;Differentfactors烟草黑胫病于1986年BredadeHaan在印度尼西亚的爪哇首次发现，此后1该病迅速传播蔓延，1934年在山东鉴定出烟草黑胫病[1]。可以侵染烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草，破坏性极强[2]，平均发病率为5%-12%，严重田块发病率高达75%，甚至造成绝收。烟草是我国重要的经济作物之一，吸烟是亿万烟民文化生活中不可缺少的一部分，也是国家和地方财税收入的重要来源。研究烟草黑胫病病原菌的生物学特性、病害发生机制等有利于从植物保护、抗病育种和耕作栽培等方面来抑制或减少烟草病害的发生，从而可以减少农药的用量，提高烟叶质量和安全性，同时也有利于环境保护。1材料和方法1.1供试材料1.1.1供试菌株烟草黑胫病0号小种由中国农业科学院烟草研究所植物保护研究室提供。1.1.2供试培养基燕麦培养基（OA）:燕麦片30g，琼脂18g，去离子水1000ml；马铃薯培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂18g，去离子水1000ml；玉米粉培养基(CMA)：玉米粉200g，琼脂17g，去离子水1000mL；番茄汁培养基(TJA)：番茄汁50ml，牛肉膏10g，乳糖20g，酵母提取液5g，琼脂17g，蒸馏水1000ml；烟草汁培养基：新鲜烟叶200g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。1.2实验设计1.2.1不同培养基和光照处理对菌丝生长的影响（1）接菌培养将上述5种培养基经121℃高压灭菌20min后，分别倒入无菌培养皿（直径88mm），挑取生长良好的黑胫病菌0号小种0.5cm2大小的菌丝块转接到培养皿中央部位。将转接菌丝的培养皿平均分成两份，分别倒置于光照和黑暗条件下28℃恒温培养。（2）试验方法从第24h起，每隔1d测量一次菌落直径（设5个重复求平均值），至菌丝长满培养皿为止。1.2.2培养基和菌龄对孢子囊数量的影响（1）实验方案用0.1%硝酸钾溶液浸泡培养7d的菌丝，镜检孢子囊数量，此后，第14d、21d、28d、35d、42d各镜检一次。（2）实验方法在超净工作台下，向不同菌龄且长满菌丝的培养皿中分别加入6ml无菌的0.1%KNO3溶液，用封口膜封住培养皿，放置于26℃恒温条件下避光培养，分别将培养12、24、48、72h的培养皿转移至温度突然降低12℃的环境下，恒温培养0.5h。然后，吸取50ul的硝酸钾浸泡液转移到干净的载玻片上，挑取有代表性约1cm2大小的菌丝放入载玻片的溶液里，制成孢子囊悬浮液，在显微镜下(10×40)随机观察3个视野，计数每个视野的孢子囊数量。1.2.3不同诱导剂和诱导时间对孢子囊和游动孢子数量的影响（1）实验方案用0.1%KNO3、0.1%KNO3和1%葡萄糖混合液分别浸泡不同菌龄的菌丝，以无菌水作为对照(CK)，设置三个重复，镜检孢子囊和游动孢子的数量。（2）实验方法同1.2.2，并用血球计数板法计算游动孢子的浓度。2结果2.1菌落及菌丝形态特征选择燕麦培养基（OA）上的供试菌株进行观察，菌丝生长旺盛，菌落质地均匀。在显微镜下观察（图1）显示，菌丝粗细不均，无隔膜，有分枝，局部有菌丝膨大体，其上有若干条放射状菌丝。孢子囊卵圆形、近球形或不规则形，通常1个、少数2个呈半球形的乳突；部分孢子囊上有丝状附属物，在条件适合时可释放游动孢子。游动孢子椭圆形或圆形，可在水中游动，遇寄主时萌发产生芽管侵入；当条件不适宜时，孢子囊可直接长出芽管侵入寄主；厚垣孢子是烟草黑胫病赖以度过不良环境的主要形态，本实验并没观察到。2.2菌丝生长与培养基和光照的关系由表1可以看出，黑胫病0号小种菌丝在5种不同培养基上28℃恒温培养生长趋势基本一致，黑暗条件下以OA培养基上的病菌平均生长速度最快，生长的菌丝最丰厚、浓密，其次是烟叶汁培养基，CMA培养基、TJA培养基和PDA培养基差别不大。光照条件下各培养基中菌丝的平均生长速度与避光条件下相似，然而，在同一种培养基上黑暗条件下培养的菌丝平均生长速度比光照条件下的稍快。在本研究提供的5种培养基中，黑胫病0号小种最适于在OA培养基上生长，光照不利于菌丝的生长。表1避光条件下不同培养基上菌丝生长速率菌种培养基类型测定数量平均菌落直径/mm菌丝平均生长速率(mm·d-1)1d2d3d4d5d烟草黑胫病0号小种OA培养基510.638.369.582.488.0≥17.6烟叶汁培养基59.328.556.971.683.116.62CMA培养基57.120.839.550.265.313.06TJA培养基58.421.637.249.862.712.54PDA培养基59.219.736.548.360.212.042.3各培养基上不同光照处理病菌的产孢量供试菌株在5种不同的培养基上均能产生孢子囊，在同一种培养基上不同光照处理的产孢量存在差异，光照下相对产孢量少，孢子囊的大小也有所不同。相同光照处理下，OA培养基上产生的孢子囊数量最多，其次是烟叶汁培养基和CMA培养基，TJA培养基和PDA培养基上产孢数量相对较少。黑暗条件下培养的菌丝产孢量普遍比光照条件下产孢量多，因此，黑暗培养有助于孢子囊的产生。2.4菌龄和产孢量的关系菌株在OA培养基上生长7d、14d、21d、28d、35d和42d后的镜检结果显示，以21d菌龄的菌丝产孢量最多，产孢能力最强；其次是14d和28d菌龄的菌丝；35d、42d和7d的菌丝产孢量依次递减。14d和28d菌龄的菌丝产孢量无明显差异，且与21d菌龄的菌丝产孢量存在差异；原因可能是，7d菌龄的菌丝处于旺长期，不适于产生孢子囊；21d以后，随着培养时间的延长，菌丝逐渐老化，产孢能力逐渐退化。考虑到实际操作、试验周期等因素，选取21d菌龄的菌丝催孢效果最佳。2.5不同菌龄的菌丝产孢量和游动孢子释放量与诱导剂和诱导时间的关系用0.1%KNO3（A液）、0.1%KNO3和1%葡萄糖混合液（B液）分别浸泡不同菌龄的菌丝，以无菌水作为对照(CK)，经过12h、24h、48h和72h的26℃恒温培养，以及0.5h、14℃的诱导培养，结果如表2所示。表2不同诱导剂和诱导时间对菌丝的作用固定项时间项孢子囊数量游动孢子数量菌龄相同处理时间不变A、B两者孢子囊数量基本一致B液处理的菌丝产生的游动孢子多处理时间增加A、B两者产孢数量均增加且基本一致，随处理时间的延长产孢量增多，浸泡72h菌丝产孢量最多A、B两者均增加，B液处理的菌丝产生的游动孢子多A液处理时间不变随菌龄增加孢子囊数量先增后减，21d菌龄产孢量最多；相同菌龄孢子囊数量基本一致随菌龄增加游动孢子数量先增后减，21d菌龄的孢子释放量最多；相同菌龄游动孢子数量基本一致处理时间增加随菌龄增加孢子囊数量先增后减，21d菌龄产孢量最多；菌龄相同，产孢数量随处理时间的延长而增加，72h孢子囊数量最多随菌龄增加游动孢子数量先增后减，21d菌龄的孢子释放量最多，游动孢子释放量随处理时间的延长而增加B液处理时间不变同A液处理时间不变有关孢子囊的实验结果同A液处理时间不变有关游动孢子的实验结果处理时间增加同A液处理时间增加有关孢子囊的实验结果同A液处理时间增加有关游动孢子的实验结果附注：在相同菌龄和相同处理时间下，经A液浸泡的菌丝和对照相比较，无菌水的菌丝产生的孢子囊数量相对较少，结果显示，0.1%KNO3溶液可促使孢子囊的产生；经A、B两液浸泡的菌丝产生孢子囊数量基本一致，但是，经B液浸泡的菌丝释放的游动孢子数较多，说明1%葡萄糖溶液具有诱导孢子囊释放游动孢子的作用。3讨论烟草黑胫病发现至今已有110多年的历史，本研究关于烟草黑胫病菌0号小种培养性状的研究结果与前人的研究[3-8]基本一致，初步认为，生态环境的改变没有导致烟草黑胫病菌的培养性状发生较大变异，即烟草黑胫病菌的培养性状是较为稳定的[9]。从本实验提供的5种供试培养基来看，烟草黑胫病菌0号小种在燕麦培养基上生长最好，说明菌株对培养基的要求存在差异，可能是病菌长期进化致使生理机能在一定程度上对营养有选择性的结果。郑小波等曾指出烟草疫霉菌部分孢子囊上有附属丝[8,10]，但有关烟草黑胫病菌的文献[11-13]中鲜有报道。本研究发现部分着生附属丝的孢子囊，附属丝的作用还有待于进一步研究。人工注射接种法是吸取游动孢子溶液直接注射到植株茎基部，游动孢子在侵染过程中起主要作用，其作用机理还有待于研究。4结论本研究的结果表明，烟草黑胫病菌0号小种对培养基有选择性，燕麦培养基较适于其生长；用0.1%KNO3溶液浸泡菌丝有助于孢子囊的产生，1%葡萄糖溶液可促使孢子囊释放游动孢子；综合各因素，选用21d菌龄的菌丝为素材，加入0.1%KNO3和1%葡萄糖溶液于26℃避光诱导72h，然后突降12℃培养0.5h，可获取大量游动孢子。鉴于本研究有关黑胫病菌培养特性的实验结果与Waterhouse、Newhook、Ho、Stamps等记述的基本一致[9]，初步认为，本所鉴定保存数十年的黑胫病0号小种的