第五章核酸的分子杂交

一、核酸分子杂交的概念二、核酸分子杂交的用途三、核酸分子杂交的原理四、核酸分子杂交的过程五、影响核酸分子杂交的因素六、核酸分子杂交的基本方法七、探针的标记八、荧光原位杂交（FISH）技术及其应用九、基因芯的概念与原理十、基因芯片的种类与应用主要内容：第一部分核酸分子杂交1.杂交(hybridization）从遗传的角度来说,杂交指基因型不同的个体之间进行的交配。遗传学中经典的也是常用的实验方法。通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体的方法。一般情况下，把通过生殖细胞相互融合而达到这一目的过程称为杂交；而把由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞杂交。一、核酸分子杂交的概念2.核酸分子杂交（nucleicacidmoleucularhybridization）是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。DNA—DNA杂交分子DNA—RNA杂交分子DNA分子DNA分子复性RNADNA核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一。用途：1.是定性或定量检测特异DNA或RNA序列片段的有力工具；2.在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的寡核苷酸或cDNA探针进行菌落杂交，可从cDNA文库或基因组文库中筛选出特定的克隆，获得某一重组体；3.用克隆化的DNA片段作探针进行Southern杂交，可确定基因组DNA上特定区域的核苷酸同源顺序；二、核酸分子杂交的用途4.用S1核酸酶或RNA酶消化DNA/RNA或者RNA/RNA杂交体是分析基因转录或RNA加工的重要方法；5.对某一已知基因或已克隆测序的基因可利用核酸杂交技术进行染色体定位；6.可用于遗传病的基因诊断，用于限制性片段长度多态性作疾病的相关分析，基因连锁分析，法医学上的性别分析和亲子鉴定。7.在人类学研究中也有应用价值。核酸分子杂交的基本原理是：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸序列和已知核酸序列。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针（probe），探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。三、核酸分子杂交的原理探针的意义：要检测某一样品或基因组DNA中特定的DNA顺序或基因片段，首先必须获得相应的探针，即已知顺序的DNA或RNA片段，并使它带上可检测到的示踪标记。ATCGGTACATTAGCCATGTA探针序列待测样本序列分子杂交的形式：⑴固—液相杂交一般在进行某一核酸顺序的检测时，先将待测的单链靶核酸固定在适当的载体上，然后置于含相应单链核酸探针的杂交反应体系中，通过碱基互补配对原则，两条单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结构。经过对标记探针的检测可以判断待检测样品中相应顺序的存在与否及分子量大小。⑵液相杂交有时也将待测核酸和已知核酸同时放在液体中进行杂交反应。两种杂交形式的基本原理都是一样的。1.变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸碱或紫外线照射，可以导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、糖苷键等）则不受影响，称为DNA变性（DNAdenaturation）。四、核酸分子杂交的过程—DNA的变性与复性导致DNA变性的常用方法有三种：⑴热变性⑵碱变性⑶化学试剂变性。变性的情况：a.T700C，DNA几乎不变性；b.700CT900C，DNA部分变性；c.T900C，DNA变性使双链打开，成为单链分子；d.T1000C，DNA双链分离。所以，一般核酸变性的温度都选在90～1000C之间。（1）热变性：当升高核酸溶液的温度时，核酸双链间的氢键发生断裂，核酸的双链逐渐打开。（2）酸碱变性：当核酸溶液的pH低于3或高于10时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。在分子杂交中，最常用的核酸变性方法是碱变性。因通常需要的核酸的载体如凝胶或膜对热都不稳定。（3）化学试剂变性：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核酸分子。除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主要的因素是DNA分子中的GC含量，GC含量高的DNA不易变性，而AT含量高的DNA容易变性。另外,环状DNA比线性DNA难于变性.DNA的变性是可逆的，即两条互补的单链DNA分子在变性条件除去后重新按碱基互补原则以氢键相连形成双链DNA分子，这一过程称作DNA复性（DNArenaturation）。如果是异源双链分子的结合则称为杂交(hybridization)。相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序的两条单股核酸链之间，如DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA或人工合成的寡核苷酸片段与DNA、RNA等。2.复性1.核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快；分子量越大，复性速度越慢。一般情况下：探针浓度为0.1～0.5μg；长度为50～300bp2.温度：适宜温度为比Tm值低250CTm—双链DNA变性一半所需要的温度(DNA的溶解温度，meltingtemperature,Tm）3.离子强度：低离子（Na+）强度下，核酸杂交非常缓慢，离子强度增加，杂交反应率增提高。所以，必须维持较高的杂交反应液和洗膜液的盐浓度五、影响核酸分子杂交的因素核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性重新缔合形成双链的过程。这一过程受到诸多因素的影响。4.杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，从而使得：（1）在低温下探针更稳定；（2）能更好地保留非共价结合的核酸。一般是：50%甲酰胺35～420C5.核酸分子的复杂性：不同顺序的总长度(碱基数）6.非特异性杂交反应：须在杂交前封闭非特异性杂交位点，以减少其对探针的非特异性吸附作用1.Southern印迹杂交（Southernblot）——鉴别DNA靶分子（待测核酸是DNA）六、核酸分子杂交的基本方法3.斑点杂交、4.原位杂交、5.核酸酶保护实验等。2.Northern印迹杂交（Northernblot）——鉴别RNA靶分子（待测核酸是RNA）根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：Southern印迹杂交是指DNA与DNA的杂交，将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。这是1975年英国爱丁堡大学的Southern建立的方法，因此而得名。基本步骤：（一）Southern印迹杂交1.待测核酸样品的制备（1）制备待测DNA：从样本的细胞或组织中制备DNA（2）DNA的限制酶消化：将DNA切割成大小不同的片段2.待测DNA样品的电泳分离：将DNA样品在0.8～1.0%琼脂糖凝胶中电泳，以对DNA片段进行分离（琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的网状物质，具有分子筛的作用，DNA因其分子大小而在琼脂糖凝胶中的泳动速度不同达到分离）。3.凝胶中核酸的变性：对凝胶中的DNA进行碱变性，使其形成较短的单链片段。4.Southern转膜：将凝胶中的DNA片段转移到硝酸纤维膜（NC）等固相支持物上。各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置是一样的，故称为印迹（blot）。（1）毛细管虹吸印迹法：利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。（见下页图）（2）电转印法：通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到滤膜上。（3）真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同。Southern转膜的方法重物湿滤纸吸水纸玻璃板胶膜湿滤纸湿滤纸桥支持平台玻璃容器20×SSC毛细管虹吸法Southern转膜示意图5.探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法制备探针、标记。7.杂交结果的检测（1）放射线标记——放射自显影，感光胶片，显出黑色杂交带；（2）非放射线标记——直接显出杂交带，进行检测。6.Southern杂交（1）预杂交封闭膜上所有能与DNA结合的位点转印后的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）4～6小时（2）杂交（过夜）分子杂交实验①②③目录放射自显影照片目录分子杂交电泳图目录8.Southern印迹杂交在医学中的应用Southern印迹杂交技术已有30余年的历史，在核酸的结构和功能研究中作出过重要贡献。如：发现成熟B细胞中免疫球蛋白基因重排现象；进行克隆基因的酶切图谱分析；特定基因的定性和定量；DNA多态性(RFLP,RAPD,AFLP等)分析……Northern印迹杂交是指将待测RNA样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固—液相杂交，以检测RNA（主要是mRNA）的方法。其基本原理和基本过程与Southern印迹杂交基本相同。只是在以下几点有所不同。（二）Northern印迹杂交1.靶核酸——RNA2.RNA电泳——在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单链线性状态）3.转膜——电泳后不需要再进行变性和中和，直接用毛细管虹吸法等方法转移。（三）斑点及狭缝印迹杂交特点：简单、快速，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定比例的假阳性。将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点印迹(dotblot)。如印迹是线状则为狭缝印迹或狭线印迹(slotblot）（四）原位杂交核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交（insituhybridization）。这是一种标记DNA与整个染色体杂交并且发生杂交的区域可通过显微镜观察的技术。特点：（1）不受组织成分的影响；（2）灵敏度高；（3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及功能；（4）可检测多个探针。核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗及信号检测等基本步骤。1.组织或细胞的固定2.组织细胞杂交前的预处理（预杂交）3.探针的选择和标记4.杂交5.杂交结果检测重点介绍荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）概念：液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子。种类：A.RNA酶保护分析法(RNaseprotectionassay,RPA)用于mRNA定量、mRNA末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。（五）液相杂交1.制备待测RNA;2.RNA探针的标记3.杂交;4.除去单链RNA5.电泳分析B.核酸酶S1保护分析法(nucleaseS1protectionassay)用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。其原理与RNA酶保护分析法类似.1.cDNA探针：逆转录→cDNA→克隆于载体→扩增重组质粒→提取质粒→消化重组质粒→切割cDNA片段→分离纯化→cDNA探针cDNA探针应用最广泛2.基因组DNA探针：从基因组文库→筛选特定基因（或基因片段）→克隆→扩增→纯化→切取片段→分离纯化→探针3.寡核苷酸探针：一定长度的寡核苷酸片段（十几个核苷酸以上）4.RNA探针：以RNA作为探针（基因克隆和体外转录获得）七、探针的标记（一）探针的种类1.核素标记物一般用α-32P,但5’末端必须用γ-32P。2.非核素标记物（1）半抗原：生物素(biotin)和地高辛(digoxin,digacin,DIG)（2）配体：生物素既是半抗原，又是亲和素(avidin，抗生物素蛋白)，故可用生物素-亲和素反应进行杂交信号检测（3）荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)（4）化学发光探针（二）标记物1.缺口平移法(nicktranslation)(见图)2.随机引物法(randonprimer)（见图）3.PCR标记法4.末端标记法（三）标记方法缺口平移法标记DNA探针DNaseⅠ；Mg2+5'3'模板DNA3'5'5'3'