您好,欢迎访问三七文档
第一节酶的固定化第二节辅酶的固定方法第三节固定化细胞第四节固定化酶的性质及其影响因素第五节固定化酶催化反应动力学对于现代工业来说,酶不是一种理想的催化剂绝大多数水溶性的酶,酶蛋白对外界环境很敏感,极易失活。催化结束后极难回收,只能进行分批生产。解决办法??第一节酶的固定化一、固定化酶(ImmobilizedEnzyme)定义:是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可回收重复使用。固定化酶优点:(1)简化了提纯工艺(2)可以装塔连续反应(3)有利于工艺自动化和微电脑化(4)多次使用(5)较游离酶相比能适应于多酶反应(6)产品质量高,成本低固定化酶缺点:①酶活力有损失②工厂初始投资大③只能用于可溶性底物,对大分子底物不适宜④与完整菌体相比,需要辅助因子的催化反应不适宜于多酶反应固定化酶的优缺点固定化酶的制备原则①必须注意维持酶的催化活性及专一性。②固定化的载体必须有一定的机械强度有利于生产自动化,连续化,不能因机械搅拌而破碎或脱落。③固定化酶应有最小的空间位阻尽可能不妨碍酶与底物的接近,以提高产品的产量。④酶与载体必须结合牢固能回收贮藏,反复使用。⑤固定化酶应有最大的稳定性所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶的制备原则⑥固定化酶应容易与产物分离,即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用。⑦固定化酶成本要低,以利于工业使用。⑧充分考虑到固定化酶制备过程和应用过程中的安全因素。固定化载体的选择标准①载体的形式②载体的结构③载体的性质④酶偶联量或装载量和实效系数二、固定化酶的制备方法结晶法分散法物理吸附法离子结合法微囊法网格法包埋法化学结合法交联法共价结合法非化学结合法1、物理吸附法(physicaladsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。选择载体的原则①要有巨大的比表面积②要有活泼的表面③便于装柱进行连续反应。常用的载体有:(1)有机载体:纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。(2)无机载体:氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。无机载体的吸附容量较低,而且酶容易脱落。2、离子结合法(在工业上具广泛的用途)将酶与含有离子交换基团的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。在适宜的pH和离子强度条件下,利用酶的侧链解离基团和离子交换基团间的相互作用而达到酶固定化的方法。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。⑴阴离子交换剂:二乙基氨基乙基(DEAE)—纤维素、混合胺类(ECTEDLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、AmberliteIRA-93、410、900等。⑵阳离子交换剂:羧甲基(CM)—纤维素、纤维素柠檬酸盐、AmberliteCG50、IRC—50、IR—200、Dowex-50等。1969年,最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-SephadexA-25固定化的。吸附法特点优点:操作简单,可供选择的载体类型多,吸附过程可同时达到纯化和固化的目的,所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少,酶活力损失很少。缺点:酶与载体相互作用力弱导致酶易脱落。吸附程度的影响因素:1.pH:影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附2.离子强度:一般认为盐阻止吸附。3.蛋白质浓度:若吸附剂的量固定,随蛋白质浓度增加,吸附量也增加,直至饱和。4.温度:蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。5.吸附速度:蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。6.载体:非多孔性载体---颗粒越小吸附力越强。多孔性载体--要考虑酶的大小和吸附面积的大小。3、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。如将聚合物的单体和酶溶液混合后,再借助聚合促进剂的作用进行聚合,将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的。包括凝胶包埋和微囊化包埋两种。(1)凝胶包埋法:将酶分子包埋在凝胶高聚物网格内的包埋方法。聚丙烯酰胺、海藻酸钠、K-角叉菜胶(卡拉胶)、胶原和明胶等先把丙烯酰胺单体、交联剂(如N,N-甲叉双丙烯酰胺)和悬浮在缓冲溶液中的酶混合,然后加入聚合催化剂(如二甲氨基丙腈与过硫酸钾)使之开始聚合,结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。特点:它的机械强度高,在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上。缺点:酶容易漏失,以低分子量蛋白质为甚。调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。聚丙烯酰胺包埋海藻酸钠它从海藻中提取出来,可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化,操作简单经济。K-角叉莱胶(卡拉胶)卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜;Cawageen)中提取的一种多糖。可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性,机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。(2)微囊化包埋法微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微囊中(如胶囊、脂质体和中空纤维)。胶囊和脂质体主要用于医学治疗;中空纤维主要适于工业使用。主要包括(1)界面沉淀法(2)界面聚合法(3)脂质体包埋法界面沉淀法物理微囊化法。它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和,酶失活少,但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。界面聚合法化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合,形成半透膜,将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微囊外观好,但不稳定,有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。此法制备的微囊大小能随乳化剂浓度和乳化时的搅拌速度而自由控制,制备过程所需时间非常短。脂质体包埋法:由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶其特征是底物或产物的膜透过性不依辅于膜孔径大小,而只依赖于对膜成分的溶解度,因此可加快底物透过膜的速度。包埋法的特点优点:反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固。缺点:只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散,对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。(适用于脲酶、天冬酰胺酶、过氧化氢酶的固定化)原因:高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变,使活力降低。查资料自学溶胶——凝胶包埋法前驱体(烷氧基硅烷及其衍生物,如TMOS和TEOS),在液相下将酶、硅源等均匀混合,经水解、缩合反应,溶液形成稳定透明的溶胶体系,溶胶进一步陈化,胶粒间缓慢聚合而形成三维空间网络结构的凝胶,在此过程中凝胶围绕酶分子而将其包埋,网络间充满了受束缚的溶剂,将溶剂进行蒸发、超临界等处理后,即获得固定化酶。4、化学结合法-共价结合法原理:酶蛋白分子上的功能基团(酶的非活性必需侧链基团)和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键,因而将酶固定在支持物上。最常用的偶联基团:-NH2、COOH、-SH、-OH、酚基、咪唑基两种固定方式1.将载体有关基团活化,然后此活泼基团再与酶分子上某一基团反应形成共价键。2.在载体上接上一个双功能试剂,然后将酶偶联上去。(4)载体活化的方法A.重氮法B.叠氮法C.烷基化反应法D.硅烷化法E.溴化氰法A.重氮法反应示意式如下A.重氮法目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基(ABSE)纤维素、琼脂糖,葡聚糖凝胶和琼脂等该方法需要载体具有芳香族氨基A.重氮法反应式及原理B叠氮法例用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶,步骤如下:⑴酯化⑵肼解⑶叠氮化(4)偶联B叠氮法对含有羧基的载体,与肼基作用生成含有酰肼基团的载体,再与亚硝酸活化,生成叠氮化合物。最后与酶偶联C.烷基化反应法含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化,形成含有卤素基团的活化载体。D.溴化氰法本方法主要用溴化氰(CNBr)活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等,其中以琼脂糖为载体的占多数(大孔网状结构)。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广,特别用作亲和层析,有着良好的性能。E.溴化氰法共价结合法中的影响因素1.要求载体亲水,并且有一定的机械强度和稳定性,同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。2.偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。3.所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。4.要考虑到酶固定化后的构型,尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。共价结合法的特点优点:固定化酶结合牢固稳定性好利于连续使用是目前应用和报道最多的一类方法。缺点:载体活化的操作复杂,反应条件激烈,需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。会影响酶的空间构象,从而影响酶的催化活性,活力回收率一般较低。4、化学结合法-交联法利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应,把酶蛋白分子彼此交叉连接起来,形成网络结构的固定化酶。目前常用的交联试剂是戊二醛。戊二醛[OHC-(CH2)3-CHO]有两个醛基,可与E-NH2生成Shiff’s碱而使酶蛋白间交联,制成固定化酶,交联时的pH通常与酶的pI相同。交联法常与吸附法结合使用,或者与包埋法配合,目的是使酶紧紧地结合于载体上。酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂,使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。例:木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度、2.3%戊二醛、pH5.2-7.2、0℃下交联24h,可形成固定化酶。固定化酶制备方法比较物理吸附离子结合包埋法交联法共价结合法制备易易难难结合力弱强强强酶活力高高中中底物专一性无变化无变化有变化有变化再生可能不可能不可能不可能固定化费用低中中高制法特性定向固定化由于酶蛋白多点附着在载体上,引起了固定化酶蛋白无序的定向和结构变形的增加。定向固定化技术的优点:(1)每一个酶蛋白分子通过其一个特定的位点以可重复的方式进行固定化;(2)有利于进一步研究蛋白质结构;(3)可以借助一个与酶蛋白的酶活性无关或影响很小的氨基酸来实现。定向固定化方法①酶和抗体的亲和连接②酶通过糖基部分固定化③酶和金属离子连接④分子生物学方法基因融合法翻译后修饰法特定位点基因突变法第二节辅酶的固定方法原因约1/3的酶的催化作用得以进行需要辅酶的参与,缺少它们,酶就不能表达其活性。在工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生,因为在反应之后,大多数有机辅因子不能自行再生,其结构往往发生改变。有机辅因子价格昂贵辅基——容易回收与酶蛋白结合比较牢固,通常可以用超滤膜截留等物理方法进行回收。辅酶——回收再生困难辅酶分子量小,难以截留再生。将其与水溶性大分子载体或水不溶性载体结合1.辅基的固定化过程:将活化的载体与连接臂连接,再以适当反应与辅基连接。连接臂活化载体辅基功能基团载体的选择没有特异性吸附具有多孔性有适合引入配基的官能团化学稳定性具有适当的机械强度等。目前使用的载体主要是琼脂糖,此外还有纤维素、玻璃珠及合成高分子材料等。连接臂的选择需考虑的因素:辅基的性质:疏水性、亲水性、离子性、体积大小长度:辅基分子和载体之间需要0.5-1.0nm长的手臂。用较长的疏水烷基作手臀时,由于亦有吸附强的能力、会使固定化辅基吸附专一性降低。偶联反应的选择利用辅基分子本身的功能基团与载体连接如磷酸吡哆醛(胺)、FAD、FMN、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等引入适当的功能基团—不能影响辅基的活性如羧基或氨基等2.辅酶的固定化载体共价偶联:与辅基的固定化方法相似或:修饰后置于超滤器引入一个功能基团,生成辅酶的衍生物——羧基或氨基衍生物再与水溶性高分子聚合物结合。选择高分子化时,要考虑的是高分子化合物的溶解度大、分子大小适当,既能保持在半透膜内,又不会过大地增加黏度而影响活性。必须将辅酶固定在水溶性载体上辅酶分子量小,难以截留再生,非常致密的超滤膜才能阻止它的流失,这样势必增加流体的流
本文标题:第三章 固定化酶
链接地址:https://www.777doc.com/doc-3385120 .html