基因工程的酶学基础

生命科学学院第二章基因工程的酶学基础基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。生命科学学院生命科学学院第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶核酶（补充）甲基化酶(补充)生命科学学院第一节限制性核酸内切酶任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制免疫系统限制/修饰系统(R-M,Restriction-modificationsystem)生命科学学院第一节限制性核酸内切酶大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修饰作用）修饰的phageλ(K)人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。一、寄主的限制与修饰现象生命科学学院第一节限制性核酸内切酶生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。•生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象与限制与修饰系统相关的三个连锁基因：hsdR:编码限制性核酸内切酶hsdM:编码DNA甲基化酶大部分的大肠杆菌菌株含有3个位点特异的DNA甲基化酶。由dam基因编码的甲基化酶把5—腺苷甲硫氨酸的甲基基团转移到序列GATC上的腺苷酸N6位置上。而dcm基因编码的甲基化酶在C5位置修饰序列CCAGG和CCTGG内部的胞嘧啶残基。hsdS:编码产物协助上述两种酶行使相应功能1968Linn和Arber从E.coliB中发现限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰的作用一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。基因工程中，应用采用缺少限制作用的菌株作为受体。K12：rk+mk+rk-mk-（用于转化实验）rk-mk+（用于转化实验）rk+mk-（自杀型表型）生命科学学院第一节限制性核酸内切酶修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基•生命科学学院第一节限制性核酸内切酶生命科学学院第一节限制性核酸内切酶二、限制性内切酶的类型限制性核酸内切酶（限制性酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型三类。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源三聚体Mg2+4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+距识别序列下游24-26bp处随机性切割基因工程中使用注：SAM为S－腺苷甲硫氨酸生命科学学院第一节限制性核酸内切酶1.I型限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。如EcoB和EcoK。（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC生命科学学院第一节限制性核酸内切酶（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。（3）作用机理需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。Recognizesitecut1-1.5kb生命科学学院第一节限制性核酸内切酶2.II类限制性内切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与DNA的来源无关。•ABCC’B’A’A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’ABB’A’ABB’A’或或生命科学学院第一节限制性核酸内切酶（2）切割位点识别位点处。切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端生命科学学院AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用生命科学学院第一节限制性核酸内切酶3.III类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。•EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG在基因工程操作中用途不大。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源三聚体Mg2+4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+距识别序列下游24-26bp处随机性切割核酸限制性内切酶的类型及主要特性生命科学学院第一节限制性核酸内切酶三、限制性内切酶的命名1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如EcoK,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略)。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶三、限制性内切酶的命名EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶四、Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（一）识别序列识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性4bpHpaⅠCCGGHaeⅢGGCC5bpAvaⅡGGWCCEcoRⅡCCWGG6bpBamHⅠGGATTCSmaⅠCCCGGG11bpBg1ⅠGCCNNNNNGGC12bpBstXⅠCCANNNNNNTGCN=A,T,G,C生命科学学院第一节限制性核酸内切酶四、Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（一）切割方式Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3‘位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶1.5’突出的末端生命科学学院第一节限制性核酸内切酶2.3’突出的末端生命科学学院第一节限制性核酸内切酶粘性末端的意义①连接便利i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。•生命科学学院第一节限制性核酸内切酶生命科学学院第一节限制性核酸内切酶3.平头末端•生命科学学院第一节限制性核酸内切酶四、Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（一）切割方式同裂酶（isoschizomers）：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生不同或相同的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大(相容性末端)。常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端杂种位点（hybridsite）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶同尾酶举例：如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。BamHI+MboIA/C/G/TGATCBamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。BamHI+BglIIA/GGATCT/C生命科学学院第一节限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件1U核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温1小时，使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0-150mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100μLTemperature37℃Time1-1.5h（DDT：二硫苏糖醇BSA：牛血清蛋白)0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Buffer生命科学学院第一节限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件在灭菌的0.5ml离心管中进行限制性酶切反应:20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2U（单位）加ddH2O至20μl多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。生命科学学院第一节限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件酶切反应的终止EDTA（终浓度10mmol/L)或SDS[终浓度0.1%(W/V)]65oC温育20min酚/氯仿抽提，乙醇沉淀酶解结果鉴定琼脂糖电泳生命科学学院