第二代测序数据分析原理

问题出发•正常样本与异常样本，如肿瘤等；•药物处理前后样本状态变化，如尼古丁刺激前后；•发育不同阶段的样本改变.............第二代测序数据分析原理徐汪节2020/5/253三代DNA测序技术之比较第一代测序技术：Sanger测序法第二代测序技术：454测序……第三代测序技术：？直接测序法：？2020/5/254第一代测序技术：Sanger测序法——简便、快速2020/5/255逐渐被遗忘的测序技术：Maxam-Gilbert的DNA化学降解法2020/5/256Sanger测序的局限通过几十年的改进，第1代测序仪的读长可以超过1000bp，原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到60万碱基。但是，不管怎么改进，第1代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化降低测序成本）。在此种情况下，第二代测序技术（Next-generationsequencing)应运而生。概要•主要的测序平台•基因组分析原理•转录组分析原理•分析策略的选择2020/5/258第二代测序技术454测序IlluminaSOLIDPolonatorCompleteGenomics……2020/5/2594542020/5/2510SOLID2020/5/2511Illumina2020/5/2512其他PolonatorCompleteGenomics……2020/5/25132020/5/2514第二代测序技术的共同点1将目标DNA剪切为小片段2单个小片段DNA分子结合到固相表面3单分子独立扩增4每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号5高分辨率的成像系统。2020/5/2515第二代测序技术的局限与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基的序列不足为奇。但是,除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成的。而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。2020/5/2516第三代测序技术：单分子测序HelicosBiosciencesVisiGenPacificBiosciencesMobiousNexusI……2020/5/25172020/5/2518直接测序法在所有上述三代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的。除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNAElectronics，IBM,NabSys，OxfordNanoporeTechnologies，Sequenom等都在进行纳米孔测序的开发，不同的只是采用的方法或策略。2020/5/25192020/5/2520Secondgenerationsequence•Roche454MetagenomicsDenovosequencingRNA-seqillumiaSolexaDenovosequencingRe-sequencingRNA-seq(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)Meth-seqABISOLiDRe-sequencingChIP-seqRNA-seqExperiments•DNA-seq:denovo,resequencing•RNA-seq:mRNA,ncRNA,smRNA...•ChIP-seq:ChromatinImmunoPrecipitation•Methyl-seq:methylatedDNA(epigenome)•主要的测序平台•基因组分析原理•转录组分析原理•分析策略的选择SequencingGlossary•Reads.Acollectionofclonesthatover-samplethetargetgenome.•Pair-endreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofasequencing-libraryclone.•Mate-pairreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofamate-pairlibraryclonewhichinsertsizeisusually1kb.•Insertsize.Thesizeoftheclone-insertfromwhichaclone-endpairistaken.•Contig.Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencereads.•Scaffold.Theresultofconnectiingnon-overlappingcontigesbyusingpir-endreads.•N50size.Asappliedtocontigsorscaffolds,thatsizeabovewhich50%odtheassembled全基因组denove分析工具PlatformCorrectionAssemblySolexaSOAPdenovoSOAPdenovoVelvet,AbyssSolidSAETVelvet454newbler分析所需工具•Bowtiesoftware-://samtools.sourceforge.net/TopHatsoftare-://Cufflinks.cbcb.umd.edu/CummeRbundsoftware-外显子组分析工具PlatformAlignmentFindVariationsSolexaSOAP,bwaSOAPsnpsamtoolsSolidBioscope,BFASTBioscope,BFAST454BLAST,NEWBLERnewbler•主要的测序平台•基因组分析原理•转录组分析原理•分析策略的选择常规分析•Transcriptsquantification•Splicingsitesdiscoveryandquantification•Genediscovery•SNP/INDELdetection•AllelespecificexpressionUniGene拼接•目的：将预处理后reads进行拼接，得到拼接结果。原理：应用deBruijngraphpath算法对reads进行denovo拼接；对上一步的拼接结果，再用HamiltonPath算法拼接。结果：UniGene序列，UniGene统计信息，序列长度分布图3.数据库注释•目的：对拼接得到的UniGene进行功能注释原理：通过blast+算法将拼接得到的UniGene序列与数据库进行比对结果：比对结果表格，物种分布统计和Evalue分布统计UniGene表达分析•目的：UniGene定量分析。原理：以UniGene为reference，分别将每个样本的reads进行referencemapping,从而得到每个样本在每个UniGenes中的一个reads覆盖度，然后应用RPKM/FPKM标准化公式对富集片段的数量进行归一化。RPKM：ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads，公式下:•UniGene表达分布图，1X，5X分别为FPKM=1，FPKM=5分界点，可以大体观察到低表达，中表达以及高表达的比例关系UniGene样本间表达相关性散点图•样本间表达差异程度的MA图，可以体现差异表达总体偏差UniGene表达差异分析•目的：对定量结果进行统计检验分析，找出差异表达UniGene原理：双层过滤筛选差异基因FC值筛选：采用Fold-change(FC)，表达差异倍数进行第一层此的差异基因筛选FDR检验：一般采用卡方检验中的fisher精确检验进行p值检验，采用BenjaminiFDR(Falsediscoveryratio)校验方法对p值进行假阳性检验，即，通过FDR显著性参数进行第二层次的差异基因筛选。组间差异基因上调与下调个数统计，可以通过此图观察上调与下调的一个总体趋势差异基因火山图，可以观察到差异基因总体分布GO功能分类•目的：利用数据库注释信息将UniGene进行GO功能分类。原理：利用数据库的注释结果，应用blast2GO算法进行GO功能分类，得到所有序列在GeneOntology的三大类：molecularfunction,cellularcomponent,biologicalprocess的各个层次所占数目，一般取到14层。结果：MF，BP，CC三大分类结果文件以及UniGene2GO关系列表，三大类别中第二层次上的柱状分布图和饼图，GO功能的层次分布图。KEGG代谢通路分析•目的：对拼接得到UniGene进行KEGGpathway映射。原理：应用KEGGKAAS在线pathway比对分析工具对拼接得到的UniGene进行KEGG映射分析。结果：标记的Pathway通路图。IPApathwayanalysis()COG注释•目的：对拼接得到UniGene进行COG功能分类。原理：利用blast+算法将拼接得到的UniGene与CDD库中的COG/KOG库进行比对，进行COG功能分类预测，将其映射到COG分类中。结果：COG分类分布情况图。SSR重复序列注释•目的：对拼接得到UniGene进行SSR简单重复序列的查找。原理：筛选标准：单核苷酸重复的次数在10次或10次以上，二核苷酸重复的次数在6次或6次以上，三至六核苷酸重复的次数在5次或5次以上。同时，也筛选中间被少数碱基(间隔小于100或等于100)打断的不完全重复的SSR。结果：重复序列的信息文件以及统计文件。LncRNA预测•目的：对拼接得到的UniGene进行LncRNA(LongnoncodingRNA)预测。原理：通过以下过程对UniGene进行过滤，最终得到候选LncRNA序列。1)Unigenelength200bp；2)UnigeneORF(OpenReadingFrame)length300；3)将满足长度条件的UniGene与多个近源物种进行进化分析，得到序列的保守性和进化特性；4)根据上述的特性和已知数据库中coding、noncoding区域的特性建立编码筛选模型；5)将符合noncoding模型的UniGene与Pfam等蛋白域数据库进行同源性比对，进一步去除可能的编码特性，最终得出LncRNA预测结果。RSAM‐01：模式动植物基因组数据和注释信息整合RSAM‐07：可变剪接分析•可变剪接体与Exonskippingjunction的识别RSAM‐08：转录起始位点（TSS）分析•TSS类和转录起始位点模式的识别•（1）通过tag聚类方法将5’端read进行聚类，识别出不同模式的TSS，例如下图所示：确定cluster的边界（黄色区•域）。•（2）每个cluster至少包含100reads,并统计这些cluster的定位和分布数量•（3）统计不同TSScluster大小宽度分布，以及转录起始模式的识别RSAM‐09.融合基因的发现（Fusiong