生化反应曲线简介

生化反应曲线简介生化室常明杰目录生化分析基本原理A生化反应曲线B物质对光吸收的基本定律－Lambert-Beer定律Lambert－Beer定律表达为:当一束平行的单色光通过含有均匀吸光物质的溶液时,溶液的吸光度(A)与溶液的浓度(C)和光透过液层厚度(L)的乘积成正比。物质对光吸收的吸光系数（e）为常数。☆其数学表达式：A=ɛ×C×L-------光吸收的基本定律I0I透射光lightdetector根据Lambert-Beer定律来计算待测物浓度如若吸光系数(ε)未知，我们就需要采用定标曲线来计算待测物的浓度。Concx=ΔAbsxxConcsAbssConcx=待测样本浓度Concs=标准品浓度ΔAbsx=样本吸光度Abss=标准品吸光度此值为定值浓度(amountofsubstance)吸光度(amountofcolor)40123456706050302010——分光光度法定量分析的依据Lambert-Beer定律适合于任何均匀非散射的介质生化比色分析特定蛋白透射比浊分析当相应的比色杯每一次通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度光路系统可以测量后分光后12个波长的相应吸光度。12有效波长:340,376,415,450,480,505,546,570,600,660,700,800nm多数检测项目都使用双波长检测方法。（可去除干扰物对检测结果的影响）0100020003000400050006000700013579111315171921232527293133353739414345474951535557596163656769AbsorbanceCyclesReactionMonitorTrigprimaryλ仪器读数原理反应转盘不停的周期旋转当相应的比色杯通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度在不同的时间点加入相应的反应试剂1终点法2速率法全自动生化分析仪常用的方法（一）终点法（endassay）•被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。•该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。终点分析法（Endpointassays）一点终点法（1-pointend）两点终点法（2-pointend）一点终点法（onepointendassay）•在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。•结果计算公式：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×KK为校准系数两点终点法在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。A单试剂两点终点法B双试剂两点终点法两点终点法的特点去除了样本的本底采用两个测量点针对两个或多个试剂的项目第一个读数点一般选在添加最后一个试剂之前第二个读数点一般选在加入最后一个试剂之后且已经达到了反应终点C+D(显色产物)+B1(试剂1)+B2(试剂2)A(样本)直接胆红素双试剂两点终点法正反应下图是校准曲线图下图是正常的质控反应曲线，波长545/658nm，读点区2个读点最终读点空白读点再看这个反应曲线R2加入后形成下降，R2试剂有不明干扰存在，更换试剂后解决为高度溶血样本产生的曲线，从R1加入开始，吸光度就急剧升高，等到R2加入反而形成负反应（R2后的终点吸光度小于样本空白），导致结果出现负数。葡萄糖正常反应曲线再看异常反应曲线原因是R2加入后的搅拌不良，反应过于迟缓，以至于在读点的时候还未到达终点，更换搅拌单元解决问题。连续监测法（continuousmonitoringassay）又称速率法（rateassay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果。连续监测法反应曲线A单试剂连续监测法B双试剂连续监测法连续监测法的优点可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值。代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。理论K值多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min×将此式中以K来表示，即为理论K值可作为分析参数输入到分析仪中。dVVst103εVt反应体系总体积Vs样品体积ε摩尔消光系数d比色杯光径dVVst103ε采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。校准K值酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好，但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。下面看我们工作中遇到的一个ALT的反应曲线为什么结果不出来？正常ALT反应曲线ALT检测原理L-丙氨酸+α-酮戊二酸α-丙酮酸+L-谷氨酸ALT血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸：生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。足够的底物开始加入R2试剂开始读点底物耗尽平台期对于这种结果，我们将此标本稀释后重新检测，但是检测后一定要再看反应曲线，如果读点区还是有一段平台区，说明我们的稀释倍数不对，我们应该加大稀释倍数，直到反应曲线没有平台区。谢谢聆听