DB37T 1780-2011 水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物残留量的测定 液相色谱

ICS65.150B50DB37山东省地方标准DB37/T1780—2011水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物残留量的测定液相色谱法2011-01-06发布2011-03-01实施山东省质量技术监督局发布DB37/T1780—2011I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心。本标准主要起草人：宫向红、刘义豪、刘慧慧、徐英江、秦华伟、任传博、邹荣婕、邓旭修。DB37/T1780—20111水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物残留量的测定液相色谱法1范围本标准规定了水产苗种中孔雀石绿(MG)、结晶紫(CV)、亚甲基蓝(MB)及其代谢物残留量的液相色谱测定方法。本标准适用于水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物隐色孔雀石绿(LMG)、隐色结晶紫(LCV)、天青A(AZ-A)、天青B(AZ-B)、天青C(AZ-C)残留量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法《水产苗种违禁药物抽检技术规范》农业部1192号公告-1-20093原理样品中残留的孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物用乙腈-乙酸铵缓冲液提取，二氯甲烷液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。4试剂4.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682一级水的标准。4.2乙腈：色谱纯。4.3二氯甲烷：色谱纯。4.4甲醇：色谱纯。4.5甲酸。4.6冰乙酸。4.7二甘醇。4.8氨水。4.9乙酸铵。4.10盐酸羟胺。4.11对-甲苯磺酸。4.1220%盐酸羟胺溶液：称取盐酸羟胺20g，溶解于100mL水中。4.131.0mol/L对-甲苯磺酸溶液：称取对-甲苯磺酸19.0g，溶解于100mL水中。4.140.125mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取9.64g乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。4.15定容液：乙腈+乙酸铵缓冲溶液（20+80，v/v）。DB37/T1780—201124.16标准品：孔雀石绿（malachitegreen，MG）、结晶紫（crystalviolet，CV）、亚甲基蓝（methyleneblue，MB）、天青A（azureA，AZ-A）、天青B（azureB，AZ-B）、天青C（azureC，AZ-C）、隐色孔雀石绿（leucomalachitegreen，LMG）、隐色结晶紫（leucocrystalviolet，LCV），纯度均大于98%。4.17标准储备溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫标准品，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准储备溶液；准确称取适量的亚甲基蓝、天青A、天青B、天青C标准品，用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备溶液。-18℃避光保存，有效期6个月。4.18混合标准中间液（1.0μg/mL）：分别准确吸取1.00mL亚甲基蓝、天青A、天青B、天青C、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的标准储备溶液至100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成1.0μg/mL的混合标准中间液。-18℃避光保存，有效期1个月。4.19混合标准工作溶液：根据需要，临用时准确吸取一定量的混合标准中间液，用定容液准确稀释至适当浓度。4.20洗脱液A：甲醇50mL，二氯甲烷50mL，氨水5mL，或按其比例，混匀。4.21洗脱液B：洗脱液A100mL，加甲酸1mL，或按其比例，混匀。5仪器与设备5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。5.2电子天平：感量0.00001g。5.3天平：感量0.01g。5.4离心机：4000r/min。5.5旋涡振荡器。5.6固相萃取装置。5.7旋转蒸发仪。5.8固相萃取小柱：DSC-MCAX，300mg，3mL；或与之相当者。5.9氧化铅柱：35mm×4.6mm（内径），柱内填料：氧化铅+硅藻土（1+1）。6测定步骤6.1样品制备按照《水产苗种违禁药物抽检技术规范》执行。6.2提取称取10g（精确至0.01g）样品于50mL离心管内，加入盐酸羟胺溶液（4.11）1.5mL，对-甲苯磺酸溶液（4.12）2.5mL，乙酸铵缓冲溶液（4.13）5mL，乙腈10mL，旋涡混匀1min，超声提取10min，4000r/min离心10min，上清液转移至100mL离心管中，残渣用乙腈10mL重复提取，合并上清液。6.3液液萃取净化在100mL离心管中加入水10mL，二甘醇2mL，二氯甲烷15mL，剧烈振荡2min，4000r/min离心10min，将下层溶液转移至100mL梨形瓶中，继续在100mL离心管中加入乙腈5mL、二氯甲烷10mL，振荡2min，4000r/min离心10min，下层溶液合并至100mL梨形瓶中，45℃旋转蒸发至近干，加3mL乙腈淋洗梨形瓶，45℃旋转蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解残渣。DB37/T1780—201136.4固相萃取净化将DSC-MCAX柱安装在固相萃取装置上，依次用5mL乙腈、5mL水活化，转移提取液到柱上，再用乙腈洗梨形瓶两次，每次2.5mL，依次过柱，用5mL水、5mL乙腈淋洗，吹DSC-MCAX柱近干，加入6mL洗脱液A（4.19），弃去第1mL洗脱液A，收集其余5mL洗脱液A于10mL离心管中，吹DSC-MCAX柱近干，加2mL洗脱液B（4.20），收集洗脱液B于另一10mL离心管中，分别于40℃下氮气吹至近干，向两个离心管中分别加入定容液溶解残留物，并定容至0.5mL，各移取400μL溶液合并，过0.45μm滤膜，供液相色谱测定。6.5测定6.5.1色谱条件6.5.1.1色谱柱：MG-C18柱，250mm×4.6mm（内径），粒度5μm，或与之性能相当者。6.5.1.2流动相：乙腈-乙酸铵缓冲溶液，梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序时间/min乙腈/%乙酸铵缓冲溶液/%020801285152585152620803520806.5.1.3流速：1.0mL/min。6.5.1.4柱温：30℃。6.5.1.5检测波长：610nm。6.5.1.6进样量：50μL。6.5.2标准曲线绘制准确量取混合标准中间液（4.17），用流动相稀释成AZ-A、AZ-C、MB浓度分别为20μg/L、40μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、800μg/L，AZ-B、MG、CV、LMG、LCV浓度分别为10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L的标准工作液。分别取50μL进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。6.5.3色谱分析在上述色谱条件下，分别取50μL混合标准工作溶液及样品溶液进样测定，标准工作溶液和样品溶液中各待测组分的响应值均应在仪器检测线性范围内。标准品保留时间参考值为：AZ-C6.45min、AZ-A7.20min、AZ-B7.76min、MB8.29min、MG11.82min、CV13.62min、LMG20.72min、LCV21.24min(见附录A)。7结果计算7.1计算DB37/T1780—20114样品中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物的残留量按公式（1）计算，结果保留三位有效数字。mVX×=ρ......................................(1)式中：X——样品中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；ρ——样品溶液中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；V——样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；m——样品的质量，单位为克（g）。8方法灵敏度、准确度和精密度8.1灵敏度本方法的定量限：AZ-C、AZ-A、MB分别为5μg/kg，AZ-B、MG、CV、LMG、LCV分别为2μg/kg。8.2准确度本方法AZ-C、AZ-A、MB添加浓度为5µg/kg～80µg/kg时，回收率为70%～120%，AZ-B、MG、CV、LMG、LCV添加浓度为2µg/kg～40µg/kg时，回收率为70%～120%。8.3精密度本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。DB37/T1780—20115AA附录A（资料性附录）色谱图AZ-C-6.520AZ-A-7.261AZ-B-7.823MB-8.355MG-11.869CV-13.666LMG-20.845LCV-21.405AU-0.0010.0000.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.010分分0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.0021.0022.0023.0024.00图A.1标准溶液色谱图（AZ-C、AZ-A、MB分别为400µg/L，AZ-B、MG、CV、LMG、LCV分别为200µg/L）AU-0.0010.0000.0010.0020.0030.0040.0050.0060.007分分0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.0021.0022.0023.0024.00图A.2空白样品色谱图AZ-C-6.497AZ-A-7.224AZ-B-7.795MB-8.325MG-11.846CV-13.643LMG-20.776LCV-21.314AU-0.002-0.0010.0000.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.008分分0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.0021.0022.0023.0024.00图A.3加标样品色谱图（添加量AZ-C、AZ-A、MB分别为20µg/kg，AZ-B、MG、CV、LMG、LCV分别为10μg/kg）_________________________________