第三章细胞的全能性与器官发生

1第三章细胞的全能性与器官发生1.植物细胞全能性、脱分化和再分化1.1植物细胞全能性（totipotency）植物细胞全能性是指一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当的条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。但是在自然状态下，由于细胞在植物体内所处位置及生理条件的不同，它的分化受到整个植株、具体器官或组织环境的束缚，致使其所具有的遗传信息不能全部表达出来，所以只能形成某种特化细胞，构成植物体的一种组织或一个器官的一部分。但它们的遗传潜力并未消失，一旦脱离原器官或组织的束缚呈游离态，并在一定的营养和环境条件下培养，就可实现其全能性。从理论上讲，只要是一个生活的细胞，都有再生出一个完整植株的潜力，但实际情况并非如此简单。就目前所知，细胞的再生潜力与其分化程度呈负相关，就是说细胞分化程度越高其再生能力越低。越老的细胞，其基因的表达就越受到严格的制约，或者说丧失功能或不表现功能的基因越多，所以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的实验材料。1.2脱分化(dedifferentiation)动物细胞的分化一般是不可逆的。植物则不同，只要具有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化的细胞，也还保持着回复到分生状态的能力。一个细胞向分生状态回复过2程所能进行的程度，取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细胞和生理状态（图3－1，见教材p39）。图3－1不同类型细胞脱分化过程可能进行的程度(引自Gautheret，1966)当把一个已经失去了分裂能力，处于分化成熟和分裂静止状态的细胞置于特定的增殖培养基上时，细胞内就会发生某些变化，从而使细胞进入分生状态。这一状态包括由溶酶体的活动而将失去功能的细胞质组分降解，并产生新的细胞质组分（即细胞器的破坏与重建），同时细胞内酶的种类与活性发生改变，蛋白质合成和细胞代谢过程也发生改变，最后引起基因表达的改变，细胞的性质和状态发生了扭转，可以说是返老还童。我们把这种由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成一种高度液泡化的呈无定形态的薄壁细胞即愈伤组织的现象（或过程）称为“脱分化”（图3－2）。1.3再分化（redifferentiation）经过脱分化的细胞如果条件合适，就可以长久保持旺盛的分裂状态而不发生分化。在一定条件下，离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株，我们把这种由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，进而构成一个3完整的植物体或植物器官的现象（或过程），叫做“再分化”（图3－3）。1.3.1细胞水平的再分化再分化中首先可见的是细胞壁变厚、假导管细胞的形成及酶水平的变化和明显的机能分化，从而形成各种类型的细胞。1.3.2组织水平的再分化当愈伤组织在高水平生长素条件下，最常见的是维管组织的分化。松散的愈伤组织内含有大量拟分生组织或瘤状结构。致密的愈伤组织内组织分化很少，大多由高度液泡化的细胞组成。1.3.3器官水平的再分化器官水平的再分化又称为器官发生。再分化的组织可形成各种器官，如根、茎或芽、叶、花以及多种变态的器官(如鳞茎、球茎、块茎等)。根据起源不同，器官发生可分为器官型和器官发生型。前者直接由外植体的细胞形成器官原基，继而发育成器官；后者由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基。在有些情况下，器官是由切下的外植体中已存在的器官原基发育而成的，但大多数是经分化重新形成的。1.3.4植株再生根和茎(包括其变态器官)或芽器官的发生可使植株重建。在离体培养中通过根、芽发生而形成再生植株的方式大致有三种：①芽产生后，芽的基部长根形成小植株；②先形成根，根上再出芽；③愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后形成维管组织把两者结合起来形4成一个植株。一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞，因此，由它所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株或植物器官的能力，即不同的“再分化”能力。一个已分化细胞若要表现其全能性首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。再分化有两种途径，一种是器官发生(organogenesis)途径，一种是胚胎发生(embryogenesis)途径。前者具体包括：①先形成芽，后在芽基部长根；②先形成根，再从根基部形成芽；③在愈伤组织不同部位分别形成芽和根，然后根、芽的维管束接通形成完整植株；④仅形成芽或根（如茶树的花粉愈伤组织诱导器官分化时，往往只形成根，而芽的发生则十分困难）。在大多数情况下，再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的，但在有些情况下，再分化可以直接发生于脱分化的细胞中，无须经历愈伤组织阶段。2.愈伤组织培养2.1愈伤组织形成的条件在一个完整的植物中，每个分化细胞都是某个器官和组织中的一个成员，它只能在与其周围成员相互协调和彼此制约当中，恰如其分地发挥整个植株所赋予它的一定的功能，而不具备施展其全能性的外部条件。然而，这些细胞若是一旦脱离了母体植株，摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织。5大量的研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下都能产生愈伤组织。由此可见，愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。当然，外植体的类型(如木本植物中的幼态或成年态)和外植体原来在植株上所处的位置(它反映了内源激素的水平)对愈伤组织诱导的影响也不能忽视。诱导愈伤组织常用的生长素是2，4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。在禾谷类植物中，多数情况下只用2，4-D就能成功地诱导愈伤组织，如在小麦未成熟胚培养中，1～2mg／L的2，4-D通常会产生很好的效果。NAA和2，4-D虽同为生长素类物质，但若以NAA代替2，4-D，上述外植体则只会生根，而不愈伤化。当以烟草茎髓、胡萝卜贮藏根和马铃薯块茎组织作外植体时，诱导愈伤组织则既需要生长素，也需要细胞分裂素。只需要一种细胞分裂素诱导愈伤组织的物种较少，白芜菁是其中之一。2.2愈伤组织形成的过程愈伤组织形成的过程分为3个时期（Yeoman等，1973；王凯基等，1981)：2.2.1诱导期诱导期又称启动期，是愈伤组织形成的起点，是外植体细胞进行分裂准备的时期。在这一时期，外植体上已分化的活细胞在外源激素和其他刺激因素的作用下，外植体细胞大小虽然没有多大变化，但其6内部却发生了生理生化变化，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大(图3－1)。诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到40h以上。图3－4油橄榄愈伤组织形成过程中各期细胞形态和RNA含量的变化（引自王凯基等，1981)2.2.2分裂期经过诱导期之后，外植体外层细胞开始迅速分裂，但中间部分的细胞不分裂，形成了一个静止的芯。在这一时期由于细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速率，细胞体积迅速变小，逐渐回复到分生状态。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，RNA含量最高时，标志着细胞分裂进入了高峰期(图3－1)。外植体细胞由原来的静止状态经过诱导期的分裂准备之后进入分裂高峰，回复为分生状态，细胞进行脱分化。处于分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。如果在原培养基上培养，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累7等，细胞将不可避免地发生分化，产生新的结构，而将其及时转移到新鲜培养基上（继代培养），愈伤组织可无限制地进行细胞分裂，维持其不分化的状态。2.2.3分化期（形成期）停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织(meristemoid)，称做分生组织结节。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节—由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，包围着内部已分化的管胞而成。以上对愈伤组织形成过程的时期并不是严格划分的，实际上，特别是分裂期和形成期往往可以出现在同一块组织上。细胞脱分化的结果在大多数情况下是形成愈伤组织，但这绝不意味着所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。一些外植体的细胞脱分化后可直接分化为胚性细胞而形成体细胞胚。2.3愈伤组织增殖的方式为了研究愈伤组织在培养期间的形态变化，Caplin(1947)把已建成的烟草愈伤组织切成小方块，置于琼脂培养基上培养，结果发现，愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面(图3－6)。82.4愈伤组织状态的调控2.4.1优良愈伤组织的特性来源于不同植物或同一种植物不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异。例如它们的颜色可能或是黄或是白，它们的外观可能或是光滑或是粗糙，它们的结构可能或是致密，或是松脆，它们的遗传生理功能可能或是具有胚性，或是不具胚性。在不同的实验中由于目的的不同，对愈伤组织状态的要求也不完全相同，但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的2～3个特性：（1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。（2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。（3）旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。（4）经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。2.4.2优良愈伤组织获得的方法为了达到以上目的，我们在诱导愈伤组织时通常采取的策略是：（1）选择适当的基因型和适当的外植体。虽然几乎所有高等植物的器官和组织都有可能产生愈伤组织，但同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同，同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同，例如小麦和其他一些禾谷类植物愈伤组织培养的9成功，在很大程度上是由于选择了未成熟胚和幼穗作为外植体，它们的根和幼叶虽然也能形成愈伤组织，但都是非胚性的。（2）选择正确的培养基，特别是正确的植物激素的种类和浓度，以及在需要配合使用生长素和细胞分裂素时，二者之间正确的配比。（3）采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。例如在玉米幼胚愈伤组织培养中，一些研究者通过在培养基中添加5mg／L或10mg／LAgNO3，抑制组织内乙烯的作用，从而使结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快的愈伤组织的频率由对照的4.99％分别提高到26.99％和34.O％(Vain等，1989)。主要根据对小麦、高梁和玉米等禾谷类植物体细胞愈伤组织培养的研究，王海波(1991)将愈伤组织分为3种主要类型：类型I结构致密，生长较慢，容易分化成苗，称为保守分裂型；类型Ⅱ结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快，称为亢进分裂型；类型Ⅲ结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡，称为衰败型。类型I和类型Ⅱ之间在一定程度上可以相互转变，衰败型细胞在一定程度上也可得到控制。能够促成这种转变和控制的因子有几种，其中最主要的是植物激素和氮源形态。一般来说，生长素是促使细胞进入亢进状态的因子，细胞分裂素是促使细胞进入保守状态的因子。氮源除了供给培养物氮素营养外，还原态氮还具有促进细胞分裂的作用，硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。当增加生长素浓度促进细胞分裂的效果不明显时，增加培养基中的氨态氮(或谷氨酰胺、精氨酸、水解酪蛋白等有机形式的还原态氮)可起到明显的促进分裂的作用；当