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1惠州学院本科毕业论文（设计）开题报告姓名王远亮学号091301326专业、班级09生科3班指导教师王国莉职称副教授课题名称苦瓜种质资源的SSR分析选题依据和意义苦瓜（MomordicacharantiaL.）又名凉瓜，是葫芦科苦瓜属蔓性一年生草本植物，我国南北各地均有栽培，尤以华南及长江流域栽培较多。苦瓜的营养价值[1]很高，其嫩果中含有丰富的矿物质、氨基酸和多种维生素，其中维生素C的含量在瓜类蔬菜中最高。此外，苦瓜具有药用价值[2]，近年来人们从其种子、果实、叶子中分离提取的多种活性成份，具有降低血糖、抗病毒、抗肿瘤、广谱抗菌和提高人体免疫力等功效。基于人们对苦瓜药食兼用双重功效的深入认识，市场对苦瓜的需求量逐年提高，栽培面积逐年扩大。苦瓜起源于印度热带地区，广泛分布于热带、亚热带和温带地区；在印度、日本和东南亚栽培历史悠久[3]。南宋时传入我国，在我国已有几百年的栽培历史。经过长期的训化、自然杂交和人工选择，苦瓜形成了丰富的品种和类型，具有广泛的遗传变异基础，果实的形状、大小、色泽以至种子的颜色和形态都有很大差异。对其亲缘关系进行正确的评价鉴定可以为苦瓜优良品种选育提供良好的理论基础。过去苦瓜主要是从形态学方面研究苦瓜种质资源，胡开林[4]等（2003）根据形态特征将24个长身类苦瓜分为5个品种群。张长远[5]等(2005)利用RAPD分子标记将45个栽培苦瓜品种分成滑身类和麻点类两大类；黄如葵[6]等（2008）对苦瓜的33个种质资源的植株、果实和种子等28类形态学性状进行聚类分析，结果表明：供试资源可划分为3个组群，即野生型组群(组群I)、密瘤小果型组群(组群II)及长大果型组群(组群III)；其中组群III又可以进一步分为3个亚组群；张凤银[7]等（2011）对44个苦瓜品种（系）的26个形态学性状调查以及反映果实营养成分的5项指标进行测定的基础上，对其进行统计分析。结果表明：在形态学性状方面，果形、果色、单果重、瓜瘤的大小，单瓜的种子数在品种（系）之间差别大，而植株的分枝性、瓜横茎以及种子的花纹等性状则差别小。形态标记简单直观、容易观察记载，是检测遗传变异最古老也最简便易行的方法。但形态很容易受生态环境变化、生育期及基因显隐性的影响，有些品种形态水平上的差别很小，导致很难客观地估计遗传变异性，从而使形态标记在植物育种中受到一些限制。目前利用分2子标记技术对苦瓜进行遗传多样性的研究已有相关报道。温庆放[8]等（2005）利用12个随机引物对24份苦瓜材料进RAPD分析。共扩增出的79条谱带，有56条为多态性带。比例为70.89%;聚类分析结果：在遗传距离为0.343时，将供试的24份苦瓜材料聚成三大类群。杨衍[9]等（2009）对36份苦瓜种质资源进行AFLP-银染分子标记技术扩增，进行遗传多样性和亲缘关系评价分析。筛选8个多态性高、分辨力强的E+3/M+3引物组合对36份供试材料的基因组DNA扩增，共获得条带数1142条，多态性条带数992条，扩增效率87％，平均每对引物扩增条带数142.75条；UPGMA分析将36份资源从变种间水平分为2个类群。高山[10]等（2010）采用RAPD和ISSR分子标记技术对38份苦瓜种质进行遗传多样性分析。结果表明:10个RAPD和10个ISSR引物分别扩增出93条和81条带,多态性比率分别为50.54%和61.29%；RAPD和ISSR标记检测供试材料的遗传相似性系数(GS)范围，分别为0.287~1和0.221~1，ISSR(平均GS值0.672)检测多态性效果高于RAPD(平均GS值0.694)。RAPD标记聚类分析将供试种质分为3个类群6组，分类结果与苦瓜瓜瘤的表型分类比较相似；ISSR标记聚类分析将供试种质分为3个类群7组,ISSR标记划分类群与形态上以颜色分类比较接近。陈禅友[11]等（2012）利用ISSR分子标记对30份苦瓜种质进行遗传多态性分析，结果表明：每个引物扩增的条带数为4~10条，平均6.07条。对ISSR结果进行聚类分析，结果表明，30份苦瓜种质间的遗传距离为0.025~0.520。在遗传距离为0.21处可将30份苦瓜种质划分成6个品种群，其亲缘关系与种质地理分布和植物学性状特征等有一定关联。近年来，国内外在苦瓜遗传育种工作中取得了一定的研究进展，主要集中在种质资源的鉴定、分类，并在此基础上开展资源的创新和杂种优势的利用。由于缺乏苦瓜种质资源多种性状遗传规律系统的基础研究，致使种质资源的创新与利用工作难以取得大的突破，选育的新品种难以聚合多个综合优良性状。因此，评价苦瓜种质资源，揭示苦瓜部分重要农艺性状的遗传规律，尤其是从分子水平上进行苦瓜种质鉴定、分类研究对于育种亲本选配上具有重要的应用价值，SSR技术对植物种质资源鉴定非常灵敏有效，能检测分辨出很小的种质遗传差异，可从分子水平上更加准确的开展种质资源遗传多样性分析[12]。目前，SSR标记技术在苦瓜种质资源研究上的应用报道较少。SSR(简单序列重复)又称为微卫星DNA(microsatelliteDNA)。SSR是一种真核生物基因组中普遍存在的重复序列，重复序列一般由1-6个碱基组成，重复次数在不同物种或同一物种不同基因型之间是高度可变的。通过3PCR扩增，便可将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上就产生长度的多态性，每1个扩增位点就代表这一位点的1对等位基因。由于重复基数的数目变化大，因此SSR显示出较强的多态性。人们把以微卫星DNA标记建立的遗传连锁图称为继RFLP作图后的第二代遗传连锁图。该技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点，此标记为共显性，所得的结果重复性高。SSR技术以孟德尔方式遗传，为共显性标记，可以区分纯合基因型与杂合基因型，具有高度的等位基因多态性，多态性强，杂合度高，分布广泛而均匀，灵敏度好，退火温度高，特异性强。SSR标记在其他物种上的标记已经得到广泛的应用。陈书霞[13]等（2012）利用6对SSR引物对40个大蒜(AlliumsativumL.)品种进行聚类分析、主成分分析及遗传多样性评价。共检测到21个多态性位点，平均每对引物可扩增出约3.5条多态性片段，多态性百分率为56.76%；SSR引物组合平均有效等位基因数、Nei基因多样度和Shannon信息指数分别为1.5551、0.3414和0.5188。聚类分析显示，6对SSR引物可把40份大蒜种质资源从0.59相似系数水平上3个类群。第一类群包含28份种质，在相似系数为0.73的水平上进一步又被分成了3个亚类；第二亚类仅包含2份种质；第三亚类包含10份种质，在0.68的相似系数水平上分成了2个亚类。丘漫宇[14]等(2012)采用25对SSR特异引物对20份番茄材料进行分析，其中21对引物扩增出条带，18对引物具有多态性，扩增出的66条谱带中有52条具有多态性，多态率为78.8%。遗传距离分析结果表明：20份番茄材料两两间的遗传距离（GD）在1.4892～9.1806之间，遗传距离大于7的育种材料共有18份，其中No.1与No.15之间的遗传距离最大，为9.1806。以遗传相似系数0.67为标准可将20份番茄育种材料划分为4大类。鉴于此，苦瓜种质资源的SSR分析旨在收集的苦瓜品种资源遗传多样性进行分析，掌握其在分子水平上种质资源间的亲缘关系，初步探讨现有资源的基因丰富程度和基因多样性的分布规律及相应的地理分布特点，为苦瓜种质资源评价和杂交育种亲本选配提供理论依据。4研究的基本内容及解决的主要问题研究内容：1.苦瓜基因组DNA的提取技术。苦瓜DNA的提取在分子生物学实验中占有很重要的地位，其提取质量对后续实验有很大的影响。2.PCR体系的建立。通过单因素实验和正交试验得出最优的PCR体系，建立清晰地多态性标记。3.筛选出多态性高的引物。并不是所有的引物都适合这个PCR体系，只有多态性高的引物才能更好的进行等位基因的标记以及苦瓜的聚类分析。4.SSR的数据处理。通常采用多态的百分数或多态信息含量（PIC）来表示信息含量。作为一种分子标记的SSR位点的信息含量与一个居群中现存等位基因的数目和频率直接成比例，与串联重复单位的数目直接相关。5.苦瓜分子标记的聚类分析。苦瓜种质资源评价和杂交育种亲本选配提供理论依据。解决的主要问题苦瓜的种质资源的遗传多样性和聚类分析研究的进度、步骤工作进度（包括时间划分和各阶段主要工作内容）1.2012年6月——2012年7月：确定苦瓜基因组DNA提取方法及DNA的提取。2.2012年7月——2012年8月：确立较优SSR—PCR体系。3.2012年8月——2012年9月：筛选出多态性高的引物。4.2012年1月——2012年4月：苦瓜基因组的SSR标记。5.2013年5月上中旬：SSR标记数据处理、分析评价、撰写研究论文和研究报告。6.2013年6月上中旬：论文修改和论文答辩。研究的方法及措施研究方法：1.文献资料法。文献资料法确定实验方法、技术路线和实验方案；2.数理统计法。用EXCEL输入数据，NTSYS作聚类图，popgen计算各种遗传参数5主要参考文献[1]李方远，徐心诚.苦瓜的营养成分与食用价值研究[J].农业与技术，2005，3:98一99[2]SubrattyAH，Gurib-FakimA，MahomoodallyF.Bittermelon：anexoticvegetablewithmedicinalvalues[J].NutritionandFoodScience,2005,35(3):143-147.[3]中国农业百科全书总编辑委员会蔬菜卷编辑委员会.中国农业百科全书·蔬菜卷[M].北京:农业出版社,1990:131[4]胡开林.长身苦瓜品种资源聚类分析[J].广东农业科学,2003,4:20-26.[5]张长远.苦瓜品种亲缘关系的RAPD分析[J].分子植物育种,2005,3(4):515-519.[6]黄如葵,孙德利等.苦瓜遗传多样性的形态学性状聚类分析[J].广西农业科学，2008，39（3）:351-356[7]张凤银，陈禅友等.苦瓜种质资源的形态学性状和营养成分的多样性分析[J].中国农学通报,2011,27(04):183-188[8]温庆放，李大忠等.不同来源苦瓜遗传亲缘关系RAPD分析[J].福建农业学报,2005，20(3):185-188.[9]杨衍,刘昭华等.苦瓜种质资源遗传多样性的AFLP分析[J].热带作物学报，2009,30（3):299-303[10]高山,林碧英等.苦瓜种质遗传多样性的RAPD和ISSR分析[J].植物遗传资源学报，2010,11(1):78-83[11]陈禅友，兰红等.苦瓜种质资源ISSR遗传多态性分析.长江蔬菜[J]，2012（12）：19-22[12]王燕龙，姜言生等.SSR分子标记在作物种质资源鉴定中的应用.山东农业科学[J]，2012，44(10):11～18[13]陈书霞,常燕霞等.大蒜种质遗传多样性的SSR分析[J].农业生物技术学报，2012,20(4):372~381[14]丘漫宇,张素平等.番茄种质资源亲缘关系的SSR分析[J].中国蔬菜，2012（24）：39-42指导教师意见指导教师（签名）：教研室意见教研室主任（签名）：系意见系主任（签名）：200年月日