microRNA

2020/1/17非编码RNA•真核生物中存在两种主要的非编码RNA(non-codingRNA),在真核生物中发挥重要作用：•一类为微小RNA(microRNA,miRNA),另一为小干扰RNA(siRNA)。•miRNA大小为19~25nt,在体内与蛋白质形成核糖核蛋白复合体(miRNP),在真核基因的表达调控、生长发育中起重要作用。•siRNA在RNA干扰(RNAinterference,RNAi)途径中起定位特异mRNA的作用。编码蛋白的基因2020/1/17非编码RNA的基因2%20%60%98%98%人果蝇线虫结核杆菌表观遗传学的主要机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰及新近发现的非编码RNA。非编码RNA：是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子。看家非编码RNA：tRNA,rRNA调控非编码RNA：长链非编码RNA（lncRNA）短链非编码RNA（siRNA、miRNA、piRNA）Non-codingRNA非编码RNA的功能1.影响染色体的结构2.调控转录3.参与mRNA选择性剪接4.参与mRNA的稳定和翻译调控过程5.影响蛋白质的稳定和转运近年来大量研究表明非编码RNA在表观遗传学修饰中扮演了重要的角色,能在基因组水平及染色体水平对基因表达进行调控,决定细胞分化的命运。非编码RNA在表观遗传学中的作用lncRNA（Longnon-codingRNA）•转录本长度超过200nt的长链非编码RNA分子；•可在多个层面（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达；•分类:①正义(Sense)lncRNA②反义(Antisense)lncRNA③双向(Bidirectional)lncRNA④基因内(Intronic)lncRNA⑤基因间(Intergenic)lncRNAlncRNA位于细胞核内或胞浆内；参与X染色体沉默、染色体修饰和基因组修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程；1.编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；2.抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；3.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；5.与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性；6.作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7.结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；8.作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子。1.编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；2.抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；3.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；5.与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性；6.作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7.结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；8.作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子。1.编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；2.抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；3.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；5.与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性；6.作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7.结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；8.作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子。siRNAsiRNA:是一类外源性的双链小分子RNA，它的长度一般为21~25nt。它在RNA干扰途径中通过引导目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表达。siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的基因敲除（knockdown）效果，这使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。SmallinterferingRNAs(siRNAs).AclassofdoublestrandedRNAs(dsRNAs)of~21nucleotidesinlength.siRNAsareproducedfromlongerdouble-stranded(bimolecular)RNAsorlonghairpins,oftenofexogenousorigin,andusuallytargethomologoussequencesatthesamelocusorelsewhereinthegenomefordestruction(genesilencing),thephenomenontermedRNAi.However,thedistinctionbetweenmiRNAsandsiRNAsisbecomingblurredasbothareproducedbysimilarpathwaysandhavesimilarmechanismsofaction.siRNAmiRNA概念：miRNA是长约21∼25nt的单链RNA,其中50%定位于易发生结构改变的染色体区域。特点：miRNA是内源性的,是生物体基因的表达产物;miRNA是由不完整的发卡状双链RNA,经Drosha和Dicer酶加工而成。•miRNA最开始的形成是源于内源性的生物体基因产生的发卡结构,该发卡结构在细胞核内经Drosha-DGCR8复合物加工产生pre-miRNA。然后pre-miRNA进入细胞质，进一步由Dicer酶切形成miRNA-miRNA二聚体，最后装载至Argonaute蛋白1(AGO1)而发挥作用。目前研究表明:•哺乳动物细胞内miRNA的调控机制反映了miRNA的特异装载蛋白AGO以及miRNA与mRNA之间的互补程度；•miRNA可通过调控组蛋白修饰引起染色质重塑；•miRNA可通过调控DNA甲基化酶的表达而影响DNA甲基化。piRNA•piRNA是近年来在哺乳动物细胞内发现的长度约为24∼31nt的RNA分子,因在生理状态下能与piwi蛋白偶联,故命名piRNA。•由于Piwi为一表观遗传学调控因子,能与PcG蛋白共同结合于基因组PcG应答元件上,协助PcG沉默同源异型基因,因此推测与Piwi相关的piRNA也应具有表观遗传学的调控作用piRNA的形成及扩增piRNA前体与piwi蛋白结合后，能在u位点进行切割形成piRNA反义链，piRNA反义链能与转座子识别，并使切割后的转座子与AGO3蛋白结合，从而进一步对转座子进行修饰切割，切割后的转座子可以与piRNA前体结合，并且在U位点切割前体，从而使切割后的前体与piwi蛋白结合，进过剪切修饰形成PiRNA和PiRNA与Piwi蛋白结合的复合体，从而使PiRNA数量增多。非编码RNA的比较种类长度（nt）来源主要功能siRNA~21~25长双链RNA转录基因沉默miRNA~21~25含发卡结构的pri-miRNA转录基因沉默piRNA~24~31长单链前体或起始转录产物等多途径生殖细胞内转座子的沉默lncRNA200多种途径基因组印记和X染色体失活结语：非编码RNA是生物体内一个重要的调控分子家族，有人提出了“RNA世界”的概念。但是，迄今为止，对非编码RNA的研究仍然是初步的，大部分功能尚未探明，主要原因是至今对它们在基因调控方面的作用还不清楚，同时非编码RNA在细胞中是低丰度存在的，不易被检测到。近来的一些研究显示，非编码RNA在转录产生的一些复合物中占有很大的比例，使人们意识到它们是重要的、有潜力的调控分子。我们相信对非编码RNA的研究将日益受到重视，对其研究也将越来越深入，有更多种类的非编码RNA分子将被发现，其功能也将逐步被阐明，非编码RNA也必将在医药等实践中得到广泛的应用。2020/1/17细胞内基因表达调控的新途径----miRNA介导的基因沉默•miRNA的发现•miRNA的作用机制•miRNA的应用领域•miRNA研究的技术路线2020/1/171993年，VictorAmbros小组以线虫为对象，用基因打靶技术研究某些基因对其发育的影响。他们找到了一个对发育有明显干扰的基因lin-4。通常线虫要通过四个幼虫阶段才能成熟，lin-4基因的突变使其只停留在第一阶段。。miRNA的发现microRNApioneer2020/1/17令人惊奇的是，他们发现lin-4并非编码一种调控蛋白，而编码小RNA分子：22nt和61nt；序列分析显示，22nt的小RNA分子是66nt（颈环结构的5’臂部分）的一部分。Ambros和GaryRuvkun(Harvard)又进一步发现，22nt的lin-4能部分的和LIN-14mRNA的3’UTR互补结合，所以他们推测，lin-4以类似反义RNA的作用机制通过与lin-14mRNA结合而下调LIN-14蛋白的表达。miRNA的发现LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell,1993,75(5):843—8542020/1/17•Specifically,lin-4wasresponsiblefortheprogressiverepressionoftheproteinLIN-14duringlarvaldevelopmentoftheworm;•mutantwormsdeficientinlin-4functionhadpersistentlyhighlevelsofLIN-14anddisplayeddevelopmentaltimingdefects.•在线虫发育阶段，Lin-4负责连续抑制LIN-14蛋白的表达•在lin-4基因突变的线虫中，LIN-14蛋白的浓度持续偏高，导致了线虫的发育停留在第一阶段。miRNA的发现2020/1/17•In2000,anotherC.eleganssmallRNAregulatorymolecule,let-7,wascharacterizedbytheRuvkunlabandfoundtobeconservedinmanyspecies,includingvertebrates.•ThesediscoveriesconfirmedthatAmbroshadinfactdiscoveredaclassofsmallRNAswithconservedsequenceandfunctions.•ThesemoleculesarenowknownasmicroRNA.miRNA的发现ReinhartBJ,SlackFJ,BassonM,etal.The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans.Nature,2000,403(6772):901—906PasquinelliAE,ReinhartBJ,SlackF,etal.Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Nature,2000,408(6808):86—89NorthernblotS1核酸酶作图2020/1/17miRNA的特征①长度一般为19－25nt，是内源性、非编码、小分子单链RNA。②一般来源于染色体非编码蛋白区的一段；③能通过与靶基因mRNA的侧翼区域特异性配对结合，引起靶基因mRNA