核酸分子杂交

核酸分子杂交技术基因工程研究所第一节核酸分子杂交的基本原理一．核酸的变性与复性二．核酸分子杂交的基本原理第二节核酸探针一．常见的核酸探针二．核酸探针的标记第三节核酸分子杂交相关技术一．传统的核酸分子杂交技术二．原位杂交第一节核酸分子杂交的基本原理一、核酸的变性与复性二、核酸杂交的基本原理一、核酸的变性与复性（一）变性当有酸、碱、热及某些变性剂（如尿素、乙醇、甲酰胺、胍等）等变性因素存在时，DNA分子双链间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA，此现象称为变性（denaturation）。DNA变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积不再存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，从而使变性后的DNA对260nm紫外光的吸光率比变性前明显增加，这种现象称为增色效应（hyperchromiceffect）。加热使DNA变性是实验室最常用的方法，称为热变性，DNA热变性发生在一个狭窄的温度范围内。通常将DNA变性达到50%时（即增色效应达到一半时）的温度称为解链温度或熔解温度（meltingtemperature），用Tm表示。影响Tm值的因素：①DNA的碱基组成。DNA的G、C含量越高，Tm值越大；A、T含量越多，Tm值越低。这是因为G-C碱基对含有三个氢键，比含有两个氢键的A-T碱基对在维持DNA的双螺旋结构中稳定性强。在标准条件下（0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸钠溶液中），Tm值与碱基对组成之间的经验公式为：Tm=69.3+0.41(G+C)%。②溶液的离子强度。溶液的离子强度增高，Tm值增大，解链温度范围较窄。这是因为DNA双链骨架上带有较多的负电荷，它们之间的静电排斥作用是双链不稳定的因素之一，而溶液中的正离子可以封闭磷酸基团的负电性，使DNA比较稳定。③溶液的pH值。核酸溶液的pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。当溶液pH值小于4或大于11时，均不利于氢键的形成。④变性剂。各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低Tm值。核酸在变性过程中，除紫外吸收值变化之外，还有粘度下降、沉降系数增加、比旋度降低、生物活性丧失等．（二）复性去除变性因素后，单链DNA能通过碱基互补重新结合成稳定的双链螺旋结构，此过程称为复性（renaturation）。DNA复性后，许多理化性质和生物活性也得到恢复。复性过程基本上符合二级反应动力学，其中第一步是相对缓慢的，因为两条链必须依靠随机碰撞找到一段碱基配对部分，先形成部分双螺旋。第二步快得多，尚未配对的其他部分按碱基配对相结合，像拉锁链一样迅速形成双螺旋。退火（annealing）：热变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，这种复性称为退火。“淬火”（quench）：将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性，这是由于温度突然降低，单链DNA分子失去碰撞的机会，因而不能复性，仍然保持单链变性的状态。将热变性DNA骤然冷却的处理过程叫“淬火”。利用“淬火”的原理，在用同位素标记的双链DNA片段进行分子杂交时，为获得单链的杂交探针，可将装有热变性DNA溶液的试管直接插入冰浴，使溶液在冰浴中骤然冷却至0℃。影响DNA复性的因素：①DNA的大小及复杂性。DNA片段越小、序列越简单，复性速率越快。因为片段越大、复杂性越高，单链DNA分子相互碰撞的几率越少。②DNA的浓度。DNA浓度越大，两条互补链相互碰撞的可能性越大，复性的速度也越快。③温度。温度过高，不利于DNA的复性；温度过低，则少数碱基配对形成的局部双链不易解离，难以继续寻找正确的配对。适宜的复性温度是比Tm值低25℃。④溶液的离子强度。因为盐能中和DNA单链中磷酸基团的负电性，减少互补链的负电荷相互排斥作用，因此增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。二、核酸分子杂交的基本原理根据核酸变性和复性的原理，不同来源的DNA变性后，若这些异源DNA之间存在某些相同序列的区域，在退火条件下则可形成DNA-DNA异源双链；或将变性的单链DNA与RNA经复性处理可以形成DNA-RNA杂合双链。这种不同来源的单链核酸分子在合适的条件下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分子杂交（molecularhybridization）。DNA2DNA1RNA探针DNA-RNA杂交DNA-DNA杂交核酸分子杂交原理示意图一、常见的核酸探针二、核酸探针的标记三、核酸探针的检测第二节核酸探针核酸探针(probes)是指能与待测的靶核酸序列互补杂交的已知序列的核酸片段。它具有高度的特异性，并且一般来讲带有某种适当的标记以便检测。根据标记方法不同，核酸探针可被粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；根据性质及来源不同，核酸探针又可被分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及寡核苷酸探针等几类。一、常见的核酸探针（一）基因组DNA探针基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内切酶不完全水解，获得许多染色体DNA的随机片段，选择长度约15-20kb的DNA片段重组到λ噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌，在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后，将目的基因DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需要时扩增。基因组DNA制备还可以通过PCR扩增基因组DNA的特定片段，然后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的内含子序列，因此，真核基因组DNA探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于cDNA探针。（二）cDNA探针以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下合成一条与mRNA互补的DNA链（cDNA），除去mRNA后，在DNA多聚酶催化下合成第二条DNA链，即形成双链DNA。再将其插入适当的载体质粒，转入细菌中扩增保存。用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列，尤其适用于基因表达的检测。（三）RNA探针将一段感兴趣的基因序列插入到载体的强启动子（通常为SP6和T7）下游的多克隆位点，用限制性内切酶在插入片段中某一适当部位或在插入片段下游的某一部位消化重组质粒，使之成为线性DNA。特定的DNA依赖性RNA聚合酶只对其相应的启动子序列有高度的亲和性（如SP6RNA聚合酶和SP6启动子，T7RNA聚合酶和T7启动子等），从而启动其下游序列的转录，以含目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。图9－３RNA探针制备示意图由于RNA探针为单链，杂交时不存在第二条链的竞争，其与待测核酸杂交的效率高，灵敏度高。同时由于RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高，杂交反应可以在更为严格的条件下进行，因而RNA探针的特异性高。RNA探针适合于Northern杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定，易被降解。（四）寡核苷酸探针由于DNA自动合成仪的出现使探针的合成十分方便。可用化学方法人工合成。人工合成的DNA片段一般长约20-50个bp（碱基）。可根据已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA探针；如不知核酸序列，可依据其蛋白产物的氨基酸顺序推导出核酸序列合成DNA探针。优点是制备较方便，但灵敏度稍差。二、核酸探针的标记理想的探针标记物应该具备的特点：有高度的灵敏度标记物与核酸的结合应不影响核酸分子的主要理化特性不影响杂交反应的特异性和杂交体的稳定性对杂交体的解链温度影响要小具有较低的假阳性率具有较高的化学稳定性标记及检测方法简单对环境无污染对人体无损伤价格低廉等（一）核酸探针标记物1.放射性同位素标记物由于放射性同位素与相应的元素之间的化学性质完全相同，对碱基配对的特异性和稳定性无影响。检测灵敏度和特异性也高于任何非放射性标记物，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测，因此放射性同位素虽然存在放射线污染、半衰期短、不能长期存放的缺点，但仍是目前应用最多的一类探针标记物。2.非放射性同位素标记物非放射性同位素标记物由于具有无放射性污染、较稳定和处理方便的优点，但是由于其灵敏度、特异性还不够理想，还不能完全替代放射性同位素在核酸分子杂交中的地位。常用的非放射性同位素标记物有地高辛、生物素、酶或荧光素系统。(1)生物素生物素生物素是一种小分子水溶性维生素，通过一条碳链臂与UTP或dUTP嘧啶环的第5位碳原子相连，对核苷酸进行标记。除dUTP外，生物素标记的dATP和dCTP也已被研制和应用。也可以将光敏基团与生物素的连接臂预先连接，形成光敏生物素，通过化学法对核酸探针进行标记。(2)地高辛地高辛（digoxingenin，Dig）又称异羟基洋地黄苷配基，是一种具有半抗原性质的化合物。地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成Dig-11-dUTP。与生物素相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高，检测产物有鲜艳颜色，反差好，背景染色低。不仅应用于Southern印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交等，以检测特定基因序列，而且更普遍地应用于原位杂交中。(3)酶常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。(4)荧光素异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC），最大吸收波长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色荧光，四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～600nm，呈橙红色荧光。德克萨斯红（TexasRed）也被广泛应用。此外还有TAMTA、吲哚二羧菁（cy3、cy4）及SYBRGreenI等。荧光素可以直接与探针核苷或磷酸戊糖骨架共价结合，也可以将生物素等连接在探针上，再利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，杂交后用偶联有荧光试剂的亲和素间接进行荧光检测。荧光素标记的核苷酸结构荧光基团通过碳链臂连接到尿嘧啶核苷的5’碳原子上，当被修饰的核苷酸掺入到DNA分子中时，荧光素基团便将DNA分子标记。右图是罗达明的结构。（二）核酸探针的标记方法根据标记物的不同分为放射性同位素标记和非放射性同位素标记。放射性同位素标记中，裂变原子只是简单地掺入探针的天然结构而取代非放射性同系物。在非放射性同位素标记方法中，核酸中正常情况下不存在的化学基团或复合物通过酶学、光化学或合成反应与探针结合。当探针与靶核酸杂交后，探针上的修饰基团可通过适当的指示系统而被检测。根据反应方式不同可将核酸探针的标记方法分为化学法和酶促法两种。化学法是利用标记物分子上的活性基团与核酸分子上的基团（如磷酸基）发生化学反应而将标记物结合到探针分子上的方法，多用于非放射性同位素的标记，如光敏生物素的标记、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等的标记。这种方法的优点是简单、快速、标记均匀。酶促法是将标记物（同位素或非同位素）预先标记在核苷酸分子上，然后通过酶促反应将标记核苷酸掺入到探针分子中，或将核苷酸分子上的标记物转移到探针分子上。这种方法是目前实验室最常用的标记方法。核酸探针的酶促标记方法种类较多，如切口平移法、随机引物法、cDNA探针的标记、DNA探针的末端标记、RNA探针以及寡核苷酸探针的标记等，可根据不同的实验需要加以选择。第三节核酸分子杂交相关技术一、传统的核酸分子杂交技术二、原位杂交1.Southern印迹杂交Southern印迹技术是1975年由EdSouthern等首次应用，因而以其姓氏命名，被广泛称为Southernblotting。Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上（硝酸纤维素膜或尼龙膜），与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。一、传统核酸分子杂交技术↓分离开的DNA片段电转移至尼龙膜上Southern印迹杂交步骤示意图标记探针与膜上DNA片段杂交→显示与标记探针杂交的DNA片段↓图9－1７-2Southern印迹杂交步骤示意图Southern印迹技术的应用：检测基因组中某一特定基因的大小、拷贝数、酶切图谱和它在染色体中的位置检测基因点突变—利用限制性片段长度多态性2