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ICS67.050X04中华人民共和国国家标准农业部869号公告-13-2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK603及其衍生品种定性PCR方法DetectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproductsQualitativePCRmethodforherbicide-tolerantmaizeNK603anditsderivates2007-06-11发布2007-08-01实施中华人民共和国农业部发布农业部869号公告-13-2007I前言本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。本标准起草单位：农业部科技发展中心、山东省农业科学院、中国农业科学院生物技术研究所。本标准主要起草人：杨崇良、沈平、路兴波、孙红炜、金芜军、尚佑芬、赵玖华、宋贵文、李宁。农业部869号公告-13-20071转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK603及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了转基因耐除草剂玉米NK603转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因耐除草剂玉米NK603及其衍生品种，以及制品中NK603的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1zSSIIb基因zSSIIbgene编码玉米淀粉合酶异构体zSTSⅡ-2的基因。3.2NK603转化体特异性序列event-specificsequenceofNK603转基因耐除草剂玉米NK603的外源插入片段3´端与玉米基因组的连接区序列，包括NOS终止子3´端部分序列和玉米基因组的部分序列。4原理根据转基因耐除草剂玉米NK603转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期108bp的DNA片段，检测试样中是否含有耐除草剂玉米NK603。5试剂、材料及溶液配制除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。5.1琼脂糖。5.210mg/mL溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭（EB），溶于100mL水中。注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。农业部869号公告-13-200725.310mol/L氢氧化钠溶液：称取80.0g氢氧化钠（NaOH），先用160mL水溶解后，再加水定容到200mL。5.4500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（5.3），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（5.3）调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.51mol/L三羟甲基氨基甲烷－盐酸溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.6TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷－盐酸溶液（5.5）和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.4），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.750×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷，先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5.4），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，用30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存。5.9DNA分子量标准：能够清楚地区分50bp～1000bpDNA片段。5.10dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。5.11TaqDNA聚合酶（5U/μL）及PCR反应缓冲液。5.12引物。5.12.1zSSIIb基因。zSSIIb-F：5´-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3´；zSSIIb-R：5´-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3´；预期扩增片段大小为88bp。5.12.2NK603转化体特异性序列。NK603-F：5´-ATGAATGACCTCGAGTAATCTTGTTAA-3´；NK603-R：5´-AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT-3´；预期扩增片段大小为108bp。5.13引物溶液。用TE缓冲液（5.6）分别将上述引物稀释到10µmol/L。5.14石蜡油。5.15PCR产物回收试剂盒。6仪器6.1分析天平，感量0.1mg。6.2PCR扩增仪。6.3泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4紫外透射仪。6.5凝胶成像系统或照相系统。6.6重蒸馏水发生器或超纯水仪。6.7其他分子生物学实验室仪器设备。农业部869号公告-13-200737操作步骤7.1抽样按NY/T672和NY/T673规定执行。7.2制样按NY/T672和NY/T673规定执行。7.3试样预处理按NY/T674规定执行。7.4DNA模板制备按NY/T674规定执行。7.5PCR反应7.5.1试样PCR反应7.5.1.1每个试样PCR反应设置三次重复。7.5.1.2在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50μL石蜡油（有热盖设备的PCR仪可不加）。7.5.1.3将PCR管在台式离心机上离心10s后插入PCR仪中。7.5.1.4进行PCR反应。反应程序为：94℃变性5min；进行35次循环扩增反应（94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长）；72℃延伸7min。7.5.1.5反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体积无菌水31.75µL10×PCR缓冲液1×5µL25mmol/L氯化镁溶液2.5mmol/L5µLdNTPs混合溶液0.2mmol/L1µL10µmol/L上游引物0.5µmol/L2.5µL10µmol/L下游引物0.5µmol/L2.5µL5U/µLTaq酶0.025U/µL0.25µL25mg/LDNA模板1mg/L2.0µL总体积50µL如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积无菌水。玉米内标准基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别为zSSIIb-F和zSSIIb-R；转基因玉米NK603转化体PCR检测反应体系中，上下游引物分别为NK603-F和NK603-R。7.5.2对照PCR反应7.5.2.1在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与7.5.1相同。7.5.2.2以非转基因玉米DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板。7.5.2.3以NK603含量为0.1%～1.0%的玉米中提取的DNA作为阳性对照PCR反应体系的模板。7.5.2.3以无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板。7.6PCR产物电泳检测农业部869号公告-13-20074按20g/L的浓度称取琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。按每100mL琼脂糖溶液中加入5µLEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取7µLPCR产物与3µL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳。7.7凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照8的规定对PCR扩增结果进行分析。如需确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照7.8和7.9的规定执行。7.8PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。7.9PCR产物的测序验证将回收的PCR产物克隆测序，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述8.1对照样品结果分析阳性对照PCR反应中，zSSⅡb内标准基因和转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出zSSⅡb基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。否则重新检测。8.2试样检测结果分析和表述a）zSSⅡb内标准基因、转化体特异性序列均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测出转基因耐除草剂玉米NK603，表述为“试样中检测出转基因耐除草剂玉米NK603，检测结果为阳性”。b）zSSⅡb内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而转化体特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出转基因耐除草剂玉米NK603，表述为“试样中未检测出转基因耐除草剂玉米NK603，检测结果为阴性”。c）zSSⅡb内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，不作判定。