微生物限度检验方法验证方案

微生物限度检验方法验证方案1.适用范围本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。2.目的通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。3.职责项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。QA现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。QC负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。QC检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。4.内容4.1.概述通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。4.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。4.2.1.验证用菌株及菌种要求大肠埃希菌【CMCC（B）44102】金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】黑曲霉【CMCC（F）98003】白色念珠菌【CMCC（F）98001】。验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。4.2.2.验证菌菌液制备4.2.2.1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备：接种大肠埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时。取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-5，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。4.2.2.2.白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-5，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。4.2.2.3.接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，吸至无菌试管内，取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-5，制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。4.2.3.供试液的制备4.2.3.1.无抑菌活性的供试品供试液的制备稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加入90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10）。固体、半固体、粘稠性供试品供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。4.2.4.菌液组测定所加的试验菌数。采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。4.2.5.试验组4.2.5.1.平皿法：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。4.2.6.供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）。4.2.8.回收率计算4.2.8.1.试验组回收率计算试验组的菌回收率＝试验组的菌回收率—供试品对照组平均菌落数×100%菌液组的平均菌落数4.2.8.2.稀释剂对照组回收率计算试验组的菌回收率＝稀释剂对照组平均菌落数×100%菌液组的平均菌落数计数方法验证至少应进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。4.2.8.结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）≥70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）≥70%。照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，使试验组菌回收率大于70%。4.3.控制菌检验方法验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的的控制菌检查方法测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。4.3.1.验证用菌株大肠埃希菌（Esherichiacoli）【CMCC(B)44102】验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。4.3.2.菌液制备大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时；分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-5，制成每1ml含菌数10～100cfu的菌悬液。4.3.3.阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，阴性对照菌不得检出。4.3.4.试验组4.3.4.1.常规法◆大肠埃希菌取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，取此培养物按《微生物限度检查SOP》大肠埃希菌项下规定检查。4.3.5.结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。5.验证的实施5.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证记录及控制菌检验方法验证记录(见附件)。5.2.分析数据，综合整个验证过程，得出验证结论。5.3.验证过程中发生的异常情况，按照《偏差处理程序》进行处理。6.相关文件《微生物限度检查SOP》7.再验证7.1.药品的组分发生改变可能影响检验结果时。7.2.验证时检验条件发生改变可能影响检验结果时。