冬虫夏草的研究进展与发展趋势

1冬虫夏草的研究进展与发展趋势靳朝霞杨少辉李明刚姜洪州*（南开大学生命科学学院天津300071）摘要：冬虫夏草是一种名贵的药用真菌,由于其自身独特的药用价值而成为各国研究的热点。本文综述了近年对冬虫夏草人工培养、深层发酵、无性型的分离与鉴定、化学成分、药理作用等方面的研究进展，并阐述了其研究趋势。关键词：冬虫夏草；无性型；深层发酵；药理作用0引言冬虫夏草[Cordycepssinensis(Berk)Sacc.]，又名虫草、冬虫草、夏草冬虫，是一种虫生真菌，属麦角菌目Clavicipitales、麦角菌科Clavicipitaceae的虫草属Cordyceps。冬虫夏草具有多种药理功能，并含有抗癌活性物质，长期以来一直被视为珍贵的中药和藏药，享誉全世界，特别在东南亚地区影响广泛。市售的冬虫夏草多为该真菌有性阶段的成熟子实体，由真菌寄生(后期腐生)在虫草蝙蝠蛾(HepialusArmorieanus)幼虫体内生长繁殖，占据整个虫体，形成僵虫，在5－6月份由头部长出子座，形成子囊孢子。成熟的子囊孢子喷出后，子座逐渐枯萎，地下的僵虫空虚，干燥后形成虫草复合体。由于冬虫夏草特殊的药用价值，使国内外对其需求量与日俱增，但受生长条件的限制，天然冬虫夏草产量很有限，且因过度采挖使天然虫草产量逐年下降，远远不能满足市场需求。因此，近年来国内外在冬虫夏草菌种分离、无性型鉴定、天然虫草与人工菌丝体的药理研究、人工培养以及菌丝体的深层培养方面进行了大量的研究，取得了一定的进展。1冬虫夏草无性型的研究冬虫夏草是一种子囊菌，其生活史可分为分生孢子阶段（无性型）和子囊孢子阶段（有性型）。在人工培养、液体发酵等实际生产中通常运用冬虫夏草菌的无性阶段，因此其菌种的正确鉴定至关重要，引起科学家高度关注。1.1冬虫夏草菌种的分离冬虫夏草菌前期寄生后期腐生，加之生长缓慢，分离获得冬虫夏草的纯菌株较为困难，因此获取纯菌种是冬虫夏草人工培育及无性型研究的关键。目前常用的分离途径主要有以下三种：从子囊孢子分离菌种。首先在产地挖取新鲜虫草，尽量在无菌条件下收取较纯净的子囊孢子，接种于琼脂培养基上，在不污染的情况下能生长出菌落；或者在子座上套一个纸袋，*责任作者Email：:[e-mail]基金项目：天津市自然科学基金资助项目（013616511）第一作者：靳朝霞（1978-）女，天津市人，硕士研究生，目前从事冬虫夏草蛋白质组学的研究工作2收集成熟的子囊孢子，经洗涤、净化、发芽后，在显微镜下挑取单个孢子接种至长出菌落[1]。从僵虫组织分离菌种。取新鲜虫草，洗净、消毒，切取僵虫小块置琼脂平板上培养，一般1～2个月能长出菌落[2]。从子座分离菌种。选择子座饱满、完整的冬虫夏草标本经酒精表面消毒后，用无菌刀片切取子座可孕部及内菌核(注意不要触及虫体肠道及体壁)，取绿豆大小的组织块置于平板培养基上培养至长出菌落[3]。1.2冬虫夏草无性型的鉴定近年来，冬虫夏草的人工发酵培养成为研究热点，国内报道与冬虫夏草有关的菌种达10个属的30多种。曾报道的无性型主要有虫草多毛孢Hirsutellahepiti、中国被毛孢Hirsutellasinensis、蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyceshepiali、中国拟青霉Paecilomycessinesis、蝙蝠蛾被孢霉Mortierellahepiali、虫草头孢霉Cephdosporiumsinensis、蝙蝠蛾柱霉Scytalidiumhepiale、中国弯颈霉Tolypocladiumsinensis、中国金孢霉Chrysosporiumsinensis、葡萄穗霉属(Stachybotry)等[4]。但这几个菌种中中国拟青霉和蝙蝠蛾被孢霉经验证发现不可能是冬虫夏草的无性型[5]。面对如此众多的菌种和名称，引发了关于冬虫夏草无性型的标准、无性型的种类以及如何确定冬虫夏草的无性型等问题的争议。目前已有证据表明，中国被毛孢（HirsutellasinensisX.J.Liu，Y.L.Guo，Y.X.Yu&W.Zeng）确属冬虫夏草无性型[6-10]。但其他报道的无性型与冬虫夏草的确切关系，尚有待进一步研究。冬虫夏草无性型的鉴定。冬虫夏草的鉴定方法很多，早在1941年小林义雄（Kobayase）就提出了确定无性型判定的五条标准：①具有虫草子座的一部分或分枝产生的无性产孢结构；②在形成虫草子实体的菌丝体上同时形成无性产孢结构；③在长出虫草子实体的同一寄主昆虫体上出现的无性产孢结构；④在同一地区长虫草子实体的同种昆虫的不同虫体上同时观察到无性产孢结构；⑤虫草的子囊孢子接种在培养基上能形成无性产孢结构。无性型分离比较传统可靠的方法是子囊孢子分离,但对于一些难以人工培养的虫草菌则不适用。对于子囊孢子难以萌发的种,可以试着利用组织分离的方法获得无性型,但此方法难以排除误定的可能；同时工作量大,需多批次多途径的进行分离。利用子囊孢子的微循环产孢(microcycleconideation)现象鉴定虫草无性型是一种简便可靠的方法。微循环产孢是丝状真菌中分生孢子萌发后无(或仅有极微弱的)菌丝生长阶段的一种重复产孢现象。利用微循环产孢鉴定虫草无性型，简便可靠，实用性强。但不同虫草菌次生子囊孢子萌发和微循环产孢的条件各不相同，因此在只获得少量子囊孢子的情况下未必能实现微循环产孢操作。另外，在未能用无性型菌株培育出批量完全形态的冬虫夏草以前，很难真正确定其是虫草的无性型[11]。王伟等总结出一套鉴定虫草无性型的方法，主要包括：①多批次多途径分离培养后相互3验证；②挑取萌发的单孢子进行纯化培养；③同时进行组织分离和子囊孢子分离，培养物相互验证；④发酵培养产物与天然虫草比较，具有相似的功能和化学组成，聚丙烯酰胺凝胶电泳后呈相同的蛋白区带，火箭线状免疫电泳(rocketlineimmunoelectrophoresis)证明两者具有相同的抗原性和交叉血清学关系；⑤纯培养物与天然虫草在药理上具有一致性[12]。这些间接的方法尽管不能最终鉴定冬虫夏草有性、无性的真实关系，但这些方法交替使用并严格相互验证，可在很大程度上避免错判。DNA指纹图谱鉴定法。李增智等从青海的冬虫夏草子实体上分离到中国被毛孢，并以RAPD为分子标记，获得了冬虫夏草和中国被毛孢相应的基因组DNA指纹图谱，两者相似率高达96%，从而证明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢[10]。赵锦等采用分子生物学手段，以rDNAITS区为分子指标，对采自西藏冬虫夏草的有性和无性阶段进行比较分析，从分子水平证明中国被毛孢是冬虫夏草的无性型[7]。运用现代分子生物学方法从基因水平进行鉴定是目前较为先进可靠的方法之一，分子生物技术的迅速发展并应用于真菌的种质鉴定，无疑给冬虫夏草的无性型鉴定提供了更客观的科学证据，但中国被毛孢是否为冬虫夏草真正的、唯一的无性型，还需深入研究。2冬虫夏草的人工培育为满足人们对虫草的需求，早在20世纪80年代初，我国就开始了人工培养虫草的研究工作，并取得了一定进展。沈南英等(1981,1983)是国内外在人工条件下，首次成功培养出冬虫夏草有性子实体。四川省中药研究所用中国被毛孢的孢子在室内接种于贡嘎蝠蛾的幼虫，于1988年首次获得了与天然冬虫夏草形态特征完全相同的人工冬虫夏草。俞永信等从天然虫草中分离得到冬虫夏草菌，并在人工培养基上进行培养生长，使其进行无性和有性繁殖，取其孢子接种于寄主昆虫，在模拟天然环境条件下长出子座，培养出与天然完全相似的冬虫夏草[5]。冬虫夏草的人工栽培必须掌握4项基本技术：①菌种用真正的无性阶段菌株(含无性孢子)或用成熟的天然子囊孢子作接种体；②寄主蝙蝠蛾的饲养技术；③侵染途径；④模拟产地的生态环境，特别是土壤、土壤和大气中的温度、湿度和光照等影响因素[13]。在完全人工控制条件下，将冬虫夏草菌感染寄主幼虫使之产生与天然冬虫夏草相同的子实体的研究方面，云南、四川等地已在高海拔地区取得了小面积培育有性型成功的经验。但由于周期长，高海拔地区无推广对象，投资大，效益不如自然采集等多种因素限制，一直未能大面积推广。然而，在低海拔地区人工培育出有性冬虫夏草尚未取得突破性的进展。3冬虫夏草菌丝体的液体深层发酵由于冬虫夏草特殊的生态环境和严格的寄生性及人工培育技术不成熟，造成产量低、资4源紧缺，价格昂贵。因此，现在多采用人工培养其菌丝体作为替代物。目前很少有人报道利用固体培养基培养虫草菌丝体。因为虽然相对于液体深层发酵，固体培养具有设备简单、发酵条件易控制、培养物中全部营养和保健成分均可充分利用等优点，但它不能分离纯菌丝体且培养周期较长，所以利用液体深层发酵培养获得冬虫夏草菌丝体、提取物或发酵液，是解决冬虫夏草药源的一种有效途径。液体发酵培养产物经药理和毒理研究，证明与天然冬虫夏草化学组成，药理作用基本一致，可代替天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺。到目前为止，液体深层发酵的研究取得了较大进展。但由于产品市场竞争的原因，有关工业化虫草菌菌丝体发酵技术还未曾有人报道。根据已发表的液体深层发酵试验结果，冬虫夏草菌丝体培养的最适条件是：中国被毛孢：最适生长温度为18-20℃，20℃以上菌丝猛涨，25℃以上则抑制生长，最适pH值为5-6，最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨、酵母膏适量配合，在有硫酸镁，磷酸二氢钾存在下生长旺盛[14]。蝙蝠蛾拟青霉：最适培养温度为18-20℃，培养基装瓶量为10%，发酵时间72h最佳，但具体培养基配方未发表[15]。被孢霉属：最适培养条件为温度26℃，发酵时间72h，培养基装瓶量为60ml/250ml，培养基配比(%)为：葡萄糖2；酵母浸汁0.5；花生饼3；蚕蛹粉0.5；奶粉0.2；磷酸氢二钠0.1；磷酸氢二钾0.15；VB11mg；VB61mg；磷酸钙0.4；硫酸镁0.025。采用此配比，发酵液的菌丝相对浓度可达54.3%[16]。北虫草菌Y3：以土豆汁20%，蛋白胨0.8%，蔗糖2%，磷酸氢二钾0.15为主的发酵培养基，温度25-26℃，转速125r/min，接种量5%，培养96-120h，可获得较高的菌丝得率[17]。头孢菌改良菌株A10：发酵培养基(%)葡萄糖4，酵母粉l，蛋白胨0.5，磷酸二氢钾0.1，七水硫酸镁0.05，pH值6.0；发酵温度为26-28℃；装瓶量为20ml/150ml；接菌量为5%；发酵30h可得菌丝体最大量[18]。4冬虫夏草的化学成分及药理作用4.1化学成分冬虫夏草真正的潜在价值或许是它们所形成的各类代谢产物，迄今人们已从虫草及其无性型中检测或分离到多种生物活性物质。冬虫夏草除了含粗蛋白25.32%，粗纤维18.53%，碳水化合物28.9%，灰分4.1%，水分10.84%外，还含有8.4%的脂肪。在脂肪中，饱和脂肪酸13.0%(硬脂酸)、不饱和脂肪酸82.8%(油酸占31.29%、β-亚油酸占68.31%)。此外，还从冬虫夏草中分离出D-甘露醇、尿嘧啶、腺嘌呤、腺嘌呤核苷、蕈糖、麦角甾醇、麦角甾醇过氧化物和胆甾醇软脂酸酯，以及具有抑菌、抗病毒、抗癌作用的虫草菌素(3ˊ-去氧腺苷)[19]。此外，从虫草发酵菌丝中分离鉴定出L-甘-L-脯环二肽等，具有抗癌(KB细胞)和增强免5疫作用的药理活性[20]。从培养的冬虫夏草IY909(KFCC-10708)得到的蛋白多糖C909具有抗癌和免疫促进活性[21]。4.2药理作用经国内外学者反复研究表明，冬虫夏草具有多种保健和药用活性。冬虫夏草自18世纪前半叶由我国传至欧洲和日本，掀起了冬虫夏草医药功能和其他经济价值的研究。从目前的研究结果，冬虫夏草的药理作用归纳起来共有九大功能：增强免疫调节，激活机体免疫功能。匡彦德经免疫功能试验证明冬虫夏草对T和B淋巴细胞有增殖作用。孟明等实验表明冬虫夏草能明显抑制小鼠脾细胞对刀豆蛋白A和细菌脂多糖的增殖反应；减少小鼠特异抗体分泌细胞数；降低同种异型抗原诱导的迟发型超敏反应及混合淋巴细胞反应[22]。来源于冬虫夏草的新型免疫抑制剂ＦＴＲ720，能直接作用于淋巴细胞，其表现免疫抑制效果，可抑制器官移植等的排斥反应[23]。