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从上世纪70年代以来，与DNA、RNA操作相关的各种分子生物学技术不断发展，到目前已经形成了一个庞大而复杂的技术体系。基因操作已成为医学研究的重要手段。简单地说，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技术。本章主要讨论如何对基因进行定性、定量分析；在随后的2章里分别介绍基因功能研究的技术和基因工程的有关内容。第十一章基因分析的基本策略1、需要进行基因的DNA序列分析:序列测定2、基因的染色体上定位：原位杂交技术3、研究基因在基因组中的拷贝数：SouthernBlot4、研究基因表达水平：NorthernBlot、逆转录实时PCR技术5、研究基因表达产物的水平：WesternBlot、流式细胞仪（FACS）对一个已知或未知基因的内容进行研究步骤：第一节利用DNA定性、定量分析可从不同角度对基因和基因组进行研究一、DNA序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化DNA测序技术：1、双脱氧链终止法(Sanger法)2、化学裂解法3、PCR测序技术4、全自动DNA测序仪这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．RayWu）独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法；M.Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。引物—延伸测序策略Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止。如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。双脱氧测序方法原理反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶I、一种ddNTP、以及四种dNTP（有一种带放射性标记）。变性胶电泳分离反应混合物。放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性。结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。TheDNAsequencingmethoddevelopedbySanger.基本步骤：1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S）；2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、不完全的化学修饰；3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断开DNA链；4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开；5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况，直接读出DNA序列。化学裂解法（Maxam-Gilbert）1977反应体系碱基修饰碱基修饰主链断裂断裂点试剂反应试剂G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G/AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C/TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶C在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACTG-3`5`*G5`*GATCACTACTG5`*G5`*GA5`*GATCA5`*GATCACTA5`*GATCACTACTG5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACT5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTACGG+AC+TCGA/GC/TC5`*G5`*GA5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTAC5`*GATCA5`*GATCACT5`*GATCACTA5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATCACTACTG硫酸二甲酯甲酸肼肼（加盐）DNA自动测序仪上述两种方法都不适应大规模DNA测定需要。存在操作步骤繁琐、效率低、速度慢的缺点，特别是读结果的读片过程。1987年发明了一种准确快速的DNA测序方法，即激光测序法和配套的自动测序仪。（用荧光染料结合引物）。随后又发明了终止标记系统法。1、揭示基因和基因组一级结构变化在医学研究中具有重要意义。2、通过DNA序列分析，可以鉴定基因和基因组变异。3、通过DNA序列分析，可以鉴定分析人工重组的基因。4、通过DNA序列测定对定点突变进行确认。DNA序列测定的意义分析基因拷贝数变化一、Southernblot检测基因拷贝数变化Southernblot印迹杂交是指DNA与DNA的杂交，将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定的固定支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。1975年英国爱丁堡大学的Southern建立了该方法，Southern印迹杂交由此得名。Southernblot步骤（1）待测核酸样品的制备：提取基因组DNA，并用适当的限制性内切酶消化水解基因组DNA，成大小不一的DNA片段。（2）待测DNA样品的电泳分离。（3）凝胶中核酸的变性：DNA在制备与电泳过程中DNA片段始终保持双链结构。电泳结束后DNA变性并转移到适当的固定支持物上才能进行Southernblot。变性通常用碱变性法。（4）Southern转膜：将凝胶中的DNA进行碱变性并将pH恢复中性后，即可将凝胶中DNA转移到固定支持物上。固定支持物：硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等。转移方法：毛吸管虹吸印迹法、电转印迹法、真空转移法。（5）已知序列的DNA探针的制备（6）Southern杂交：在将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能够结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合，在进行杂交实验前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。（7）杂交结果的检测：采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和X线片装入暗盒，感光后，经冲洗，在X线片上可见黑色条带。提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜与DNA或RNA探针杂交放射自显影DNA印迹杂交（Southernblotting）检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因1、对某种生物体基因组拷贝数研究，需要完整提取出基因组，并需要适当的限制性内切酶酶切；2、通常要研究的基因序列是已知的。3、探针序列的选择和探针信号的选择。Southernblot检测基因拷贝数注意事项二、采用PCR技术也可以分析基因拷贝数原理：细胞内DNA复制是一个复杂过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，PCR原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对简单。PCR反应体系：耐热的TaqDNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物、4种dNTP、以及合适的缓冲液体系。PCR反应的基本过程：变性、退火、延伸PCR技术对扩增的模板浓度虽然很低，扩增产量以一个恒定的指数率上升，但经过25至30个循环，产量会达到一个平台期，同时PCR过程中，还会出现“试管效应”，因些对不同样本量的比较无法直接用PCR技术来鉴定。近年来，随着PCR技术的不断改进，如差异显示PCR和实时PCR的发明，可以用于基因拷贝数的分析。根据PolyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。（1）差异显示PCR用于基因拷贝数分析将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。差异显示PCR方法仍然存在几个难以解决的问题：(1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重复；(2)假阳性率可以高达90%；(3)获得的差异表达序列极少包含编码信息。（2）代表性差异分析技术该技术是将差减杂交与PCR有机结合形成的一种方法.主要步骤:1、将对照组(driver)和待测组(tester)mRNA逆转录成cDNA片段群,接上接头进行第一次PCR扩增;2、将两组PCR产物片段群用限制性内切酶酶切,形成平均长度256bp的长度；3、将接头消化,在tester组末端接上新的接头,tester组和driver组按1:100比例混合，过量的driver可与tester中互补的部分形成双链；4、复性,按新接头序列设计引物进行第2轮PCR，只有tester和tester杂合体才能和引物配对,大量扩增；实时PCR根据PCR反应动力学特点设计的分析方法。在PCR反应的初始阶段，反应体系中的模板的产物浓度较低，而引物是过量的，产物和模板复性不会形成与引物竞争，此时产物含量呈指数增加。当PCR产物积累后，产物的复性可以竞争引物与模板的结合，产物增加减慢，最后进入平台期。所以对样品中的cDNA进行定量分析的最佳时期是反应早期。（3）实时PCR用于基因拷贝数分析实时PCR原理是：在PCR反应体系中加入一种双色荧光标记的寡核苷酸探针，并根据探针上荧光信号的变化计算模板DNA含量。如：TaqMan系统。在寡核苷酸探针的5`端标记一个报告荧光染料，3`端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激活的报告荧光染料将能量转移给附近的猝灭染料而不发光。当PCR产物扩增时，聚合酶遇到结合在模板上的荧光探针时，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用，将两种染料分离，因此根据报告荧光所发射的荧光强度与被切探针成正比，由此可以计算出PCR产物的含量。实时PCR技术特别适合于低拷贝基因的定量。实时PCR需要包括热循环仪、计算机、光学仪器用于荧光激发和收集器、数据处理和分析软件。ROMA分析基因拷贝数ROMA（代表性寡核苷酸阵列分析）：是将RDA与芯片微距阵分析技术相结合。利用人类基因组序列预测并设计了能与代表性片段杂交的寡核苷酸探针，制成芯片，然后与RDA筛选出来的代表性差异PCR产物在芯片上进行杂交，用计算机分析杂交结果。核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。原位杂交不需要从组织提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可完整保持组织与细胞形态，更能准确反映出组织细胞的相互关系及功能状态。三、原位杂交技术可以分析基因在染色体上位置根据检测对象不同可将原位杂交分为细胞内原位杂交和组织切片原位杂交。同时原位杂交既可检测DNA，也可检测RNA，所用探针不同而已。核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。放射性同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，非放射性探针可以用生物素、地高辛、荧光素标记探针。（一）固定：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。最常用的固定剂是多聚甲醛，其它的固定剂（如戊二醛）。（二）玻片和组织切片的处理：包括玻片处理、细胞组织切片的处理、降低背景、预杂交。（三）杂交：调整探针的浓度（0.5～5.0ng/μl）、探针长度（50～100个碱基）、杂交的温度和时间。基本方法（四）杂交后处理：包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。（五）显示：根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。（