2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1专题2微生物的培养与应用课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题背景尿素是一种重要的农业氮肥。但尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。土壤中细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶。相关方程式如下：研究思路（一）筛选菌株(1)自然界中目的菌株筛选的依据是根据它对的要求，到相应的环境中去寻找。(2)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时或其他微生物生长。(3)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。【实例】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：（1）从物理性质看此培养基属于哪类？（2）在此培养基中哪些作为碳源、氮源？【相关链接】利用选择培养基设计实验分离纯化微生物①真菌：用含的培养基分离。②金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分离。③固氮微生物：用培养基分离。④自养型微生物：用含的培养基分离。⑤光合细菌：用含无机碳源的培养基在无氧而有光照的环境中分离。⑥厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在条件下分离。⑦乳酸菌：用乳酸含量较高，pH较低的普通培养基分离。⑧假单胞杆菌：用石油作为唯一碳源的培养基分离。KH2PO4NaH2PO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素琼脂1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g2（二）统计菌落数目(1)常用方法：法。(2)统计依据：当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌。(3)平板选择菌落计数时一般选菌落数在的平板，计数公式为每克样品中的菌落数＝。参数含义依次为C，V，M。【相关链接】统计微生物数目的方法1．显微镜直接计数法(1)原理：利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。(2)方法：用计数板计数。(3)缺点：不能区分死菌与活菌。（4）血球计数板血球计数板图示①计数室容纳液体的体积为0.1mm3（即10ˉ4ml）。②血球计数板有9大格、25中格、16小格和9大格、16中格、25小格两种规格。都是400小格。常用的是25中格x16小格的血球计数板。25中格x16小格的血球计数板计算公式:酵母细胞数/ml=(5中格个数/5)×25×104×稀释倍数2．间接计数法也叫活菌计数法或稀释涂布平板法（三）设置对照(1)对照实验：是指除了以外，其他条件都相同的实验。(2)主要目的：排除实验组中对实验结果的影响，提高实验的度。3实验设计(1)土壤取样①土壤微生物大约70%～90%是。②细菌适宜在酸碱度的土壤中生长，绝大多数分布在距地表的土壤层。(2)样品的稀释样品的直接影响平板上生长的，选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证菌落数在之间，便于计数。(3)微生物的培养与观察每隔统计一次菌落数目，最后选取数目时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。操作提示(1)无菌操作①取土样的用具在使用前都需要。②应在旁称取土壤。并在附近将土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在旁操作。(2)做好标记本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就。结果分析与评价内容现象结论有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染培养物中菌落数偏高被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入其他杂菌选择培养基的筛选作用牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用样品的稀释样品的稀释操作得到三个或三个以上菌落数目在30～300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近4课题延伸细菌合成的将尿素分解成，使培养基的增强。在以为唯一氮源的培养基中加入指示剂培养细菌，若指示剂变，可确定该种细菌能够分解尿素。5答案专题2微生物的培养与应用课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题背景研究思路（一）筛选菌株(1)自然界中目的菌株筛选的依据是根据它对环境的要求，到相应的环境中去寻找。(2)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。(3)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。【实例】（1）固体培养基（2）碳源：葡萄糖氮源：尿素【相关链接】利用选择培养基设计实验分离纯化微生物①真菌：用含青霉素的培养基分离。②金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分离。③固氮微生物：用无氮培养基分离。④自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离。⑤光合细菌：用含无机碳源的培养基在无氧而有光照的环境中分离。⑥厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在无氧条件下分离。⑦乳酸菌：用乳酸含量较高，pH较低的普通培养基分离。⑧假单胞杆菌：用石油作为唯一碳源的培养基分离。（二）统计菌落数目(1)常用方法：稀释涂布平板法法。(2)统计依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个菌落。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌。(3)平板选择菌落计数时一般选菌落数在30～300的平板，计数公式为每克样品中的菌落数＝(C6÷V)×M。参数含义依次为C某一稀释度下的平均菌落，V涂布平板时所用的稀释液的体积，M稀释倍数。【相关链接】统计微生物数目的方法（三）设置对照(1)对照实验：是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验。(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度。实验设计(1)土壤取样①土壤微生物大约70%～90%是细菌。②细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3～8㎝的土壤层。(2)样品的稀释样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目，选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证菌落数在30～300之间，便于计数。(3)微生物的培养与观察每隔24h统计一次菌落数目，最后选取数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。操作提示(1)无菌操作①取土样的用具在使用前都需要灭菌。②应在火焰旁称取土壤。并在火焰附近将土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。(2)做好标记本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记。课题延伸细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。7